本发明专利技术公开了一种骨关节炎的诊断工具，该诊断工具是通过检测AGAP9基因及其表达产物来实现诊断目的的。本发明专利技术研究证明与正常滑膜组织相比，骨关节炎患者AGAP9基因的mRNA表达水平显著上调。根据AGAP9基因与骨关节炎之间的存在的相关性，可以制备诊断骨关节炎的试剂盒，该试剂盒可在临床上广泛应用。
Application of AGAP9 in the preparation of products for diagnosis of osteoarthritis
The invention discloses a diagnostic tool for osteoarthritis, which realizes the diagnostic purpose by detecting AGAP9 gene and its expression products. Compared with normal synovial tissue, the expression level of AGAP9 gene in osteoarthritis patients is significantly increased. According to the correlation between AGAP9 gene and osteoarthritis, a kit for the diagnosis of osteoarthritis can be prepared, which can be widely used in clinic.
【技术实现步骤摘要】
AGAP9在制备诊断骨关节炎的产品中的应用
本专利技术涉及疾病诊断领域，更具体地，本专利技术涉及以检测AGAP9异常为手段的疾病诊断方法。
技术介绍
骨关节炎(OA)作为中老年人较常见的一种慢性、进展性关节疾病，可表现为不同程度的关节肿痛、活动受限等症状，以关节软骨和软骨下骨进行性破坏、关节滑膜炎症反应为主要病理特征，其发病机制迄今尚不完全清楚，早期诊断困难，临床上常用的诊断手段往往针对中晚期患者，早期患者作为一个特殊人群，其早期诊断水平对其健康结局的影响更为直接和明显。骨关节炎被认为是一种慢性疾病，可以长时期保持“沉默”，临床诊断其早期阶段颇为困难；诊断通常是基于临床症状和影像学变化。然而X线有一个可怜的灵敏度和精度，只提供了一个累积损伤，误差相对较大，不能提前检测骨关节炎或监控关节损伤的进展。CT及MRI也同样存在一些问题。由于这些工具的局限性，当前可供评估早期阶段的骨关节炎，只有生物标志物：研究集中于软骨基质的结构组件，尤其是II型胶原降解产物。然而国内外一些学者的实验结果证明单纯检测II型胶原降解产物，仍不能解决诊断早期阶段骨关节炎的灵敏度和精度问题，这样慢慢就形成这样的共识：单纯检测H型胶原降解产物行不通。近年人们更多关注细胞因子IL-1上，特别是，其被认为是骨关节炎发展的核心因素以及单核苷酸多态性基因生物标记物和借助代谢组学等技术，也许有利于检测早期骨关节炎。可能替代的方法，如分子标记，能够量化的，可靠地，敏感地检测骨关节炎的关节在早期阶段的变化。该实验目前还没有走到将来那一步，只是借助目前更成熟更容易普及的临床检测方法，尝试其可行性。在分子水平上尤其是在基因水平上进行骨关节炎的早期诊断已经成为了骨关节炎诊断领域的发展趋势，在诊断方面，申请号为：201510548635.X、2015105495645、2015105486241、201510627048.X、2015107250040、201510724747.6、2015107257552专利文献均披露了可以用于骨关节炎诊断的基因标志物。本申请是在现有技术的启示下寻找新的可以用于骨关节炎诊断的生物标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于诊断骨关节炎的基因标志物。本专利技术利用测序和QPCR实验证明了AGAP9基因在骨关节炎滑膜组织的的表达水平显著高于正常滑膜组织，因此可将AGAP9基因作为诊断骨关节炎的基因标志物。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种用于诊断骨关节炎的产品，所述产品包括检测AGAP9基因表达的试剂。进一步，所述试剂包括能够定量AGAP9基因mRNA的试剂，和/或能够定量AGAP9蛋白的试剂。进一步，本专利技术前面的所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨关节炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知AGAP9基因的异常与骨关节炎相关也属于AGAP9基因的用途，同样在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的试剂盒包括特异扩增AGAP9基因的引物。作为本专利技术的一个具体实施例，所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。本专利技术的试剂盒还可以包括：SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增AGAP9基因和/或管家基因的引物对。优选地，所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述PCR缓冲液包含：25mMKCL，2.5mMMgCL2，200mM(NH4)2SO4。所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的实施方案中，扩增AGAP9基因的正向序列5’-TAAGAAGAAGCAACTGTA-3’(SEQIDNO.1)，反向序列5’-GTGTGATATGATGAGGTA-3’(SEQIDNO.2)；管家基因优选β-actin，扩增该基因的正向引物序列为5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQIDNO.3)，反向引物序列为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQIDNO.4)。进一步，本专利技术的试剂盒还可以包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。优选地，逆转录反应液包含：250mMTris-HCL(pH8.3)、375mMKCL、15mMMgCL2、50mMDTT。RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。优选地，本专利技术的试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。本专利技术的试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了检测AGAP9的试剂在制备诊断骨关节炎的产品中的应用。进一步，所述检测AGAP9的试剂包括检测AGAP9基因表达的试剂。更进一步，所述检测AGAP9基因表达的试剂包括能够定量AGAP9基因mRNA的试剂，和/或能够定量AGAP9蛋白的试剂。定量AGAP9基因mRNA的试剂包括：如PCR、Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等定性地、定量地、或半定量地检测基因mRNA表达水平的方法中使用的任何试剂。进一步，所述定量AGAP9基因mRNA的试剂包括QPCR中使用的引物，和/或探针。在本专利技术的具体实施方案中，所述定量AGAP9基因mRNA的试剂包括QPCR中使用的引物，所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。上面所述的引物可以通过化学合成来制备，使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。前面所述的探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。定量AGAP9蛋白的试剂包括如ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等能够检测蛋白表达水平的方法中使用的任何试剂。本专利技术可用于定量AGAP9蛋白的试剂包括针对AGAP9蛋白的抗体，所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。前面所述的本专利技术的所述产品检测的样本不受特别限制，只要它适于本专利技术的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本专利技术的具体实施方案中，所述样本来自受试者的组织。本专利技术还提供了一种诊断骨关节炎的方法，所述方法包括如下步骤：(1)获取受试者含有AGAP9基因表达产物的样本；(2)检测样本中AGAP9基因或蛋白的表达水平；(3)将测得的AGAP9基因或蛋白的表达水平与受试者患病与否关联起来；(4)与正常滑膜组织相比，如果AG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于诊断骨关节炎的产品，其特征在于，所述产品包括检测AGAP9基因表达的试剂。
【技术特征摘要】
1.一种用于诊断骨关节炎的产品，其特征在于，所述产品包括检测AGAP9基因表达的试剂。2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述试剂包括能够定量AGAP9基因mRNA的试剂，和/或能够定量AGAP9蛋白的试剂。3.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括特异扩增AGAP9基因的引物，所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘跃洪，周宇，陈曦，王志聪，张建军，汪红，杨灵，江伟，
申请(专利权)人：德阳市人民医院，
类型：发明
国别省市：四川,51
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