一种以人MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法技术

本发明专利技术涉及生物领域。目的是提供一种以人MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法，该方法通过对人MUC13的定量检测，获得肝细胞癌的相关信息，并根据检测中采用的PCR扩增结果开展基于肝癌MUC13表达水平的患者生存时间预测。技术方案是：一种以MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法，包括以下步骤：(1)从被检人群获取人体组织样本，然后进行RNA提取及逆转录；(2)检测人体组织样本中的MUC13；(3)若被检组织样本中MUC13ΔCT低于正常组织样本MUC13ΔCT平均值的，则提示被检组织样本中具有癌肝细胞；所述步骤2中的检测通过荧光实时定量核酸扩增检测(QPCR)进行；所采用的MUC13荧光实时定量PCR(QPCR)引物为：正向5’‑CCTTCGGTGTGATTATTATGGC‑3′；反向5′‑GCATCTGGCTGTCTCTGGAG‑3′。

A method of detection of human MUC13 as a specific marker for hepatocellular carcinoma

【技术实现步骤摘要】
一种以人MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法
本专利技术涉及生物领域，具体是以人黏蛋白基因MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法。
技术介绍
肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC,简称肝癌),是世界上第五高发的恶性肿瘤，致死率位列第三。目前我国的肝癌患者人数居高不下，约占全球肝癌病人的55％，严重影响人们的身体健康。目前肝癌诊断除了传统的病理学诊断及影像学辅助诊断外，分子诊断方兴未艾，为个体化判断患者疾病亚型及疾病进展情况提供有力证据。常见的肝癌分子诊断标记物有：甲胎蛋白、热休克蛋白70、磷脂酰肌醇、γ-谷氨酰转移酶、转化生长因子(TGF-β1)及胰岛素样生长因子II等。传统的病理学诊断及影像学辅助诊断对肝癌疾病具有可靠的诊断效力，但却缺乏个体化提示作用，也对肿瘤的基因相关信息没有任何提示作用，也因此无助于后续的基因靶向治疗。而已有的肝癌分子诊断标记物包括常用的甲胎蛋白等，其假阳性率和假阴性率较高，容易造成误诊或漏诊。判断肝癌患者预后指标有许多，常用的为病理分期、临床分期、治疗转归等。此外众多基因被发现对肝癌患者预后具有提示作用，如血清甲胎蛋白、肿瘤组织p53、细胞角蛋白10/19、骨桥蛋白、Dickkopf-1等，但目前尚未找到最佳指标或组合。因此进一步寻找其特异性分子标志物有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服上述
技术介绍
的不足，提供一种以人MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法，该方法通过对人MUC13的定量检测，获得肝细胞癌的相关信息，并能根据检测中采用的PCR扩增结果开展基于肝癌MUC13表达水平的患者生存时间预测。本专利技术提供的技术方案是：一种以MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法，包括以下步骤：1)从被检人群获取人体组织样本，然后进行RNA提取及逆转录；2)检测人体组织样本中的MUC13；3)若被检组织样本中MUC13ΔCT低于正常组织样本MUC13ΔCT平均值的，则提示被检组织样本中具有癌肝细胞；所述步骤2中的检测通过荧光实时定量核酸扩增检测(QPCR)进行；所采用的MUC13荧光实时定量PCR(QPCR)引物为：正向5’-CCTTCGGTGTGATTATTATGGC-3′反向5′-GCATCTGGCTGTCTCTGGAG-3′。所述步骤2中的QPCR，采用的对照引物为：正向5’-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3′反向5′-CTGATCGTCTTCGAACCTCC-3′。作为推荐，所述步骤2中，正常组织样本的MUC13ΔCT平均值为15.5。所述步骤1)中的RNA提取及逆转录，包括利用Trizol进行RNA提取和利用RNA逆转录试剂盒逆转成互补DNA(cDNA)。所述MUC13PCR引物和对照引物合成时，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)纯化。所述MUC13PCR引物和对照引物使用时，采用三蒸水稀释至工作液浓度10μM。本专利技术的有益效果是：1)肝癌的分子标记物有许多，但特异性均不好。本专利技术发现MUC13在44.0％的肝癌患者中显著升高，并与患者肿瘤包膜形成、肿瘤大小、癌栓形成和肿瘤分级相关等临床参数相关，因此专利技术人认为MUC13可作为肝癌特异性分子标记物。2)血清甲胎蛋白、肿瘤组织p53、细胞角蛋白10/19、骨桥蛋白、Dickkopf-1等均可作为肝癌患者的生存预判的分子指标，但预判价值都不尽理想，寻找疾病生存预判的指标具有重要意义。本专利技术发现MUC13表达高的患者平均生存时间为64.1±5.8个月，显著低于MUC13表达低的患者的平均生存时间89.2±5.2个月。结果证明MUC13是可作为肝癌生存预判的良好的分子标记物。附图说明图1是MUC13蛋白在肝癌组织与肝正常组织中的表达水平比较图(每个点代表一个样品)。图2是MUC13蛋白在肝癌组织(Non-tumor)与肝正常组织(Normal)中的显微照片比较图。图3是MUC13蛋白在肝癌组织(T)与肝正常组织(N)中的Western检测比较图。图4是基于QPCR分析得到的MUC13表达水平对肝癌患者总生存时间(A)和无病生存时间(B)的Kaplan-Meier分析图。图5是基于免疫组织化学得到的MUC13表达水平对肝癌患者总生存时间(A)和无病生存时间(B)的Kaplan-Meier分析图。图6是基于QPCR分析得到的MUC13ΔCT值对肝癌患者总生存时间的预测价值分析图。具体实施方式以下结合附图所示的实施例进一步说明。本专利技术提供的以MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法，包括以下步骤：1)从被检人群获取人体组织样本，然后进行RNA提取，并反转录成互补DNA(cDNA)；2)检测人体组织样本中的MUC13；检测通过QPCR进行,所采用的MUC13PCR引物为：正向5’-CCTTCGGTGTGATTATTATGGC-3′反向5′-GCATCTGGCTGTCTCTGGAG-3′。对照引物为：正向5’-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3′反向5′-CTGATCGTCTTCGAACCTCC-3′以上引物序列由深圳华大基因科技有限公司合成；合成时采用PAGE法(变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)纯化；使用引物时，需用三蒸水稀释至工作液浓度为10μM。3)若被检组织样本中MUC13ΔCT低于正常组织样本MUC13ΔCT平均值的(MUC13表达水平与MUC13ΔCT水平呈反比)，则提示被检组织样本中具有癌肝细胞。1.MUC13的定量检测步骤及关键试剂和仪器关键试剂和仪器1)Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)2)RNA逆转录试剂盒(Roche,Basel,Switzerland)3)SYBRGreenPCR试剂盒(Roche,Basel,Switzerland)4)普通PCR仪5)荧光定量PCR仪检测关键步骤1)新鲜组织标本获取及处理新鲜标本一般来源于活体穿刺或手术大体标本。取得的组织应尽快至于4度冰盒中，并在5-10分钟内转移至液氮中。标本在液氮浸泡时间不少于1个小时。标本可在液氮中长期保存或于-80度冰箱保存不超过6个月。1)RNA提取a)取100mg组织放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末；b)加入1mlTrizol裂解组织；c)裂解物转移至1.5ml离心管，加入0.2ml氯仿，振荡均匀后12,000g离心15分钟；d)吸取上清至另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后12,000g离心10分钟；e)弃去上清，向沉淀物加入1ml75％乙醇，8,000g离心5min，弃上清；f)风干沉淀物，加入三蒸水溶解RNA；g)用紫外分光光度计测OD值，计算RNA的浓度和纯度。分装后-80℃保存RNA。2)利用RNA逆转录试剂盒逆转RNAa)在PCR管中加入以下试剂：b)普通PCR仪65℃孵育5分钟，0℃冰水浴1分钟；c)短暂离心后在管中加入以下试剂：d)混匀后再短暂离心；e)普通PCR仪50℃孵育60分钟；f)普通PCR仪70℃孵育15分钟灭活转录酶活性，-80℃保存产物。3)QPCR(荧光实时定量核酸扩增检测系统)检测应用FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Roche荧光定量试剂盒)进行QPC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法，包括以下步骤：1)从被检人群获取人体组织样本，然后进行RNA提取及逆转录；2)检测人体组织样本中的MUC13；3)若被检组织样本中MUC13 ΔCT低于正常组织样本MUC13 ΔCT平均值的，则提示被检组织样本中具有癌肝细胞；所述步骤2中的检测通过QPCR进行；所采用的MUC13荧光实时定量PCR引物为：正向5’‑CCTTCGGTGTGATTATTATGGC‑3′反向5′‑GCATCTGGCTGTCTCTGGAG‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种以MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法，包括以下步骤：1)从被检人群获取人体组织样本，然后进行RNA提取及逆转录；2)检测人体组织样本中的MUC13；3)若被检组织样本中MUC13ΔCT低于正常组织样本MUC13ΔCT平均值的，则提示被检组织样本中具有癌肝细胞；所述步骤2中的检测通过QPCR进行；所采用的MUC13荧光实时定量PCR引物为：正向5’-CCTTCGGTGTGATTATTATGGC-3′反向5′-GCATCTGGCTGTCTCTGGAG-3′。2.根据权利要求1所述的以MUC13作为肝细胞癌特异标志物的检测方法，其特征在于：所述步骤2中的QPCR，采用的对照引物为：正向5’-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3′反向5′-CTGATCGTCTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴永东，刘璐璐，赵鹏，关新元，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33