一种检测KRAS基因G12C位点的特异性引物对、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测KRAS基因G12C位点的特异性引物对、探针及试剂盒，本发明专利技术的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3‑4所示。本发明专利技术引物基于KRAS基因G12C位点设计，利用上述特异性引物对和探针，采用数字PCR的方法检测待测血液基因组DNA或游离DNA中KRAS基因G12C位点，特异性好且灵敏度高，检测结果准确性高，在检测突变同时可以直接给出基于位点的突变频率，具有重要的应用价值。

A specific primer pair, probe and kit for detecting the G12C loci of the KRAS gene

The invention provides a method for detection of KRAS G12C gene specific primer, probe and kit, nucleotide sequence specific primer of the invention such as SEQ ID NO.1 2 shows, 4 probe nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.3. The primers of KRAS G12C gene based on the design of the specific primers and probe, detection method using digital PCR to measure the blood genomic DNA or KRAS free DNA in G12C gene, good specificity and high sensitivity, the detection results of high accuracy in detecting the mutation and mutation frequency are directly based on site that has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种检测KRAS基因G12C位点的特异性引物对、探针及试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，具体地说，涉及一种检测原癌基因KRAS基因G12C位点的特异性引物对、探针及含有其的试剂盒。
技术介绍
KRAS基因编码主要涉及调节细胞分裂的K-Ras的蛋白质。作为被RAS/MAPK途径的信号途径的一部分，蛋白质将来自细胞外的信号转导至细胞的细胞核。这些信号指示细胞生长和分裂或成熟并发挥专门的功能(分化)。K-Ras蛋白是一种GTP酶，这意味着它将GTP的分子转化为GDP的另一种分子。K-Ras蛋白质像一个开关，它由GTP和GDP分子打开和关闭。为了传递信号，K-Ras蛋白必须通过附着(结合)至GTP分子而开启。当K-Ras蛋白将GTP转化为GDP时，其被关闭(灭活)。当蛋白质与GDP结合时，它不会将信号传递至细胞的核。KRAS基因属于一类致癌基因的基因。当突变时，癌基因具有引起正常细胞变为癌的潜力。KRAS基因在癌基因的Ras家族中，其还包括两个其他基因：HRAS和NRAS。这些蛋白质在细胞分裂，细胞分化和细胞自我破坏(细胞凋亡)中起重要作用。原癌基因KRAS是EGFR信号通路中的重要分子之一，根据以往的研究表示，突变型KRAS基因始终处于激活状态，不受上游EGFR基因状态的影响，只有野生型(未突变型)KRAS基因受上游EGFR信号刺激的影响，这也是具有突变型KRAS基因患者对EGFR抑制剂(TKIs)治疗无效的理论基础。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸凋亡，这种异常在胰腺癌、大肠癌、肺癌等恶性肿瘤中的发生率较高。在胰腺癌中，KRAS基因的点突变发生率高达90％以上。美国国立综合癌症网络(NCCN)《结直肠癌临床实践指南》(V3.2011)中明确指出：(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；(2)只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如爱必妥和帕尼单抗)治疗。同时NCCN《非小细胞肺癌临床实践指南》(V2.2011)中也指出：当KRAS基因发生突变时，不建议使用EGFR-TKIs靶向治疗药物。此外，我国卫生部颁布的《结直肠癌诊疗规范》中明确提出：(1)结直肠癌行病理组织学检查，确定为复发或转移性结直肠癌时，检测肿瘤组织K-ras基因状态。(2)结直肠癌手术标本的病理报告内容和要求中应包括K-ras基因状态，确定为复发或转移性结直肠癌。如无手术切除标本可从活检标本中测定。(3)晚期/转移性结直肠癌化疗治疗前检测肿瘤K-ras基因状态，EGFR不推荐作为常规检查项目。美国FDA已经强制要求用药前进行EGFR、KRAS等基因检测。在国内，KRAS基因检测的开展得到中国抗癌协会的倡导。在此背景下，国内相继开展了KRAS基因的检测和相应治疗工作，KRAS基因检测已逐渐发展为恶性肿瘤常规检测项目之一。目前，有关KRAS突变的检测方法很多，大部分基因突变检测技术都是基于PCR进行的。利用二代测序的方法周期长，费用相对较高；利用荧光定量PCR的周期虽然较短，但是荧光定量PCR的技术在一定程度上属于相对定量，需要依靠标准曲线进行具体浓度的计算，精确度有限；利用数字PCR进行后期治疗的预后观察周期短，成本低且有针对性。数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的PCR检测方法，其工作原理在于将DNA或cDNA样品分割为许多单独、平行的PCR反应体系，部分这些反应包含了靶标分子(阳性)，而其他不包含(阴性)。单个分子可以被扩增一百万倍或更多，能够提高现有TaqMan测定的性能，从而实现更高的灵敏度、准确度，避免假阴性结果的出现。标准PCR反应体系经过微滴发生后，分配到约20000个微滴中，每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号，没有模板的微滴就没有荧光信号产生。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种成本低、准确度灵敏度高的检测KRAS基因G12C位点的方法。本专利技术首先提供一对用于检测KRAS基因G12C位点的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。前向引物：5’-GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACT-3′(SEQIDNO.1)反向引物:5’-GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT-3′(SEQIDNO.2)本专利技术提供了与上述特异性引物对配合使用的探针组合，所述探针组合的核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示。进一步地，SEQIDNO.3所示探针的5’标记VIC，3’标记MGB-NFQ，SEQIDNO.4所示探针的5’标记FAM，3’标记MGB-NFQ。本专利技术设计的探针组合，具体序列为VIC：5’-VIC-TTGGAGCTGGTGGCGTA-MGB-NFQ-3′；FAM：5′-FAM-TTGGAGCTTGTGGCGTA-MGB-NFQ-3′。含有SEQIDNO.1-2所示特异性引物对和/或SEQIDNO.3-4所示探针的试剂盒或检测试剂属于本申请的保护范围。本专利技术提供了上述特异性引物对和探针组合或含有其的试剂盒在检测KRAS基因G12C位点中的应用。本专利技术的试剂盒，其工作程序为：(1)提取待测血液样品的基因组DNA或游离DNA；(2)以提取的基因组DNA或游离DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物对和权利要求2所述的探针组合，进行数字PCR扩增反应；(3)根据荧光信号给出的拷贝数判定结果。其中步骤(2)数字PCR扩增反应的程序为：95℃预变性10min；94℃变性20s，58℃退火及延伸45s，共40个循环；98℃固化微滴10min。本专利技术提供一种检测血液中基因组DNA或游离DNA中KRAS基因G12C位点的方法，包括如下步骤：(1)提取待测血液样品的基因组DNA或游离DNA；(2)以提取的基因组DNA或游离DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物对和权利要求2所述的探针组合，进行数字PCR扩增反应；(3)根据荧光信号给出的拷贝数判定结果。上述方法中，步骤(2)中进行数字PCR扩增反应的程序为：95℃预变性10min；94℃变性20s，58℃退火及延伸45s，共40个循环；98℃固化微滴10min。本专利技术提供了用于检测血液基因组DNA或游离DNA中KRAS基因G12C位点的方法和检测试剂盒，适用于检测出EGFR突变的癌症患者治疗方案的选择。本专利技术采用微滴数字PCR技术，针对KRAS基因G12C位点突变设计一对特异性引物对及与其配合使用的两条探针。由于原癌基因KRAS是EGFR信号通路中的重要分子之一，根据以往的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测KRAS基因G12C位点的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测KRAS基因G12C位点的特异性引物对，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。2.与权利要求1所述的特异性引物对配合使用的探针组合，所述探针组合的核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示。3.如权利要求2所述的探针组合，SEQIDNO.3所示探针的5’标记VIC，3’标记MGB-NFQ，SEQIDNO.4所示探针的5’标记FAM，3’标记MGB-NFQ。4.含有权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求2所述探针组合的试剂盒。5.含有权利要求1所述特异性引物对和/或权利要求2所述探针组合的检测试剂。6.权利要求1所述的特异性引物对和权利要求2-3任一所述的探针组合或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的检测试剂在检测KRAS基因G12C位点中的应用。7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：(1)提取待测血液样品的基因组DNA或游离DNA；(2)以提取的基因组DNA或游离DNA为模...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈凌波，车健为，高贵丽，
申请(专利权)人：广州漫瑞生物信息技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44