一种与脑动脉瘤相关的临床标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与脑动脉瘤相关的临床标志物，包括miR‑628‑3p、miR‑505‑5p、miR‑3074‑3p、miR‑497‑5p、miR‑224‑5p、miR‑181b‑5p和let‑7b‑5p中的任意一种或任意几种。本发明专利技术还涉及一种脑动脉瘤发病检测用试剂盒或脑动脉瘤发生诊断用试剂盒，该试剂盒包含上述临床标志物中的任意一种或任意几种及其对应的引物。本发明专利技术还涉及一种上述试剂盒在诊断脑动脉瘤发病的判定方法中的应用或在脑动脉瘤诊断中的临床应用。本发明专利技术首次发现外泌体miR‑628‑3p作为脑动脉瘤的临床标志物具有很高的准确性。若将上述miRNA标志物组合则更能够准确地判断脑动脉瘤发病，即通过使用本发明专利技术的脑动脉瘤外泌体miRNA临床标志物及其脑动脉瘤发病判定方法，能够得到可靠性更高的诊断结果。

A clinical marker associated with cerebral aneurysm and its application

The invention discloses a cerebral aneurysm associated with clinical markers, including 628 3P, any miR miR 505 5p, miR 3074, miR 3P 497 5p, miR 224, miR 5p 181b 5p and let 7b 5p or any of several. The invention also relates to a kit for detecting the incidence of cerebral aneurysms or a diagnostic kit for the diagnosis of cerebral aneurysms, which contains any one or any of the above clinical markers and corresponding primers. The invention also relates to the application of the aforementioned kit in the diagnosis of the onset of cerebral aneurysm or in the diagnosis of cerebral aneurysm. The invention first found in exosomes miR 628 3P as a cerebral aneurysm clinical marker with high accuracy. If we combine the above miRNA markers, we can more accurately predict the incidence of cerebral aneurysms, that is, we can get a more reliable diagnosis by using the miRNA clinical markers of cerebral aneurysms and intracranial aneurysms.

【技术实现步骤摘要】
一种与脑动脉瘤相关的临床标志物及其应用
本专利技术涉及基因工程及神经学领域，具体涉及一种与脑动脉瘤相关的临床标志物及其应用。
技术介绍
脑动脉瘤是一局部管壁薄弱、膨出而产生的脑血管瘤样突起，其破裂后引起蛛网膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage，SAH)是最常见的脑血管病之一，其发病率仅次于脑梗死和高血压性脑出血，年发病率约为8-16例/10万人，约80％的蛛网膜下腔出血是由动脉瘤造成。动脉瘤破裂后死亡率达40％，致残率高达33％，如未及时诊治2年内的死亡率达60％。一般认为未破裂动脉瘤的在成年人群中的发病率为2％-7％，而且发病率随着年龄的而增加。颅内动脉瘤就像留在颅内的“不定时炸弹”，将随时危及患者的生命。因此，早期发现，适时根治脑动脉瘤，以避免脑动脉瘤破裂和二次破裂是救治脑动脉瘤患者的根本措施。目前数字减影血管造影术(DSA)仍是诊断颅内动脉瘤的金标准。但DSA具有侵入性、辐射性、耗时多、相对昂贵等缺点。尽管CTA诊断颅内动脉瘤速度快且准确性与敏感性较高，但CTA需使用造影剂，可以有肾功能损害和过敏反应，同时CTA也有辐射损伤。尽管3.0TMRA具有很高度准确性、敏感性，基本可以替代DSA来诊断和筛查颅内动脉瘤。由于MRA扫描时间加上后处理时间较长，约15分钟，因此大规模的颅内动脉瘤检测诊断明显存在滞后性。颅内动脉瘤发生发展的机制仍然不明确，影响因素复杂。颅内动脉瘤的发生发展不仅与年龄、性别、吸烟、酗酒、高血压、糖尿病、高血脂、感染等有密切关系，而且也与遗传与环境有密切关系。各种因素相互刺激，再加上脑血管相对其他部位血管，具有外膜薄弱，缺乏弹力纤维，中膜平滑肌细胞少，内弹力层不发达，促使动脉慢性扩张，导致动脉瘤最终形成。目前对于颅内动脉瘤的诊断、预后及评估主要依赖于影像学、血流动力学、生物模型建立等，这些手段存在明显的滞后性，无法对动脉瘤进行早期诊断。目前尚缺乏一种能准确、快速和大规模检测未破裂颅内动脉瘤的有效方法。而针对颅内动脉瘤开展的临床生物标志物的研究将有助于脑动脉瘤的快速和大规模诊断及个体化防治，并为揭示疾病的发病机制打下基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提出一种能够准确地判断脑动脉瘤发生及其发病风险的miRNA(microRNA)标志物，对于迄今为止文献报告的临床标志物，虽然观察到了这些标志物存在与否和脑动脉瘤发病具有相关性，但相关的程度不充分，另外，几乎不存在能够进一步提高风险评价的可靠性的脑动脉瘤临床标志物的组合。本专利技术使用与脑动脉瘤发病的相关性高的有用的miRNA作为临床标志物，更优选使用现实中临床上能够测定的范围内的数个有用的与脑动脉瘤相关的miRNA作为临床标志物，并实施该脑动脉瘤miRNA标记物的相关应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种与脑动脉瘤相关的临床标志物，其包括miR-628-3p、miR-505-5p、miR-3074-3p、miR-497-5p、miR-224-5p、miR-181b-3p和let-7b-5p中的任意一种或任意几种。本专利技术的第二个目的是提供一种上述与脑动脉瘤相关的的临床标志物在制备脑动脉瘤发病检测用试剂盒或脑动脉瘤发生诊断用试剂盒中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种脑动脉瘤发病检测用试剂盒或脑动脉瘤发生诊断用试剂盒，其包括miR-628-3p、miR-505-5p、miR-3074-3p、miR-497-5p、miR-224-5p、miR-181b-3p和let-7b-5p中的任意一种或任意几种及其对应的引物。进一步地，所述miR-628-3p的引物序列如SEQIDNO：1所示，所述miR-505-5p的引物序列如SEQIDNO：2所示，所述miR-3074-3p的引物序列如SEQIDNO：3所示，所述miR-497-5p的引物序列如SEQIDNO：4所示，所述miR-224-5p的引物序列如SEQIDNO：5所示，所述miR-181b-3p的引物序列如SEQIDNO：6所示，所述let-7b-5p的引物序列如SEQIDNO：7所示。进一步地，所述试剂盒还包括内参U6或内参cel-miR-39及其对应的引物。进一步地，所述U6的引物序列如SEQIDNO：8～SEQIDNO：9所示，所述cel-miR-39的引物序列如SEQIDNO：10所示。进一步地，所述试剂盒还包括常用的试剂和酶。上述各引物的碱基序列如下表所示：本专利技术的第四个目的是提供一种上述脑动脉瘤发病检测用试剂盒或脑动脉瘤发生诊断用试剂盒在诊断脑动脉瘤发病的判定方法中的应用或在脑动脉瘤诊断中的临床应用。进一步地，所述临床标志物为miR-628-3p。进一步地，当将miRNA标志物作为脑动脉瘤发生判定的临床标志物时，miRNA标志物的相对表达水平2-ΔΔCt值与正常对照相比在10倍以上。或者，进一步地，当将miRNA标志物作为脑动脉瘤发病风险判定的临床标志物时，随着脑动脉瘤的增大，miRNA标志物的相对表达水平2-ΔΔCt值也逐渐增大。本专利技术的第五个目的是提供一种检测与脑动脉瘤相关的临床标志物的方法，其包括如下步骤：步骤1：在动脉血或外周静脉血中提取外泌体miRNA；步骤2：采用上述试剂盒利用miDETECTATrackTMmiRNAqRT-PCR成熟链检测方法对步骤1提取的miRNA进行检测；其中，miRNA包括miR-628-3p、miR-505-5p、miR-3074-3p、miR-497-5p、miR-224-5p、miR-181b-3p和let-7b-5p中的任意一种或任意几种。进一步地，所述miDETECTATrackTMmiRNAqRT-PCR成熟链检测方法包括miRNART反应和miRNAqPCR反应，其中在miRNART反应中，引物浓度范围为200nM～800nM，RT反应程序为：42℃60min，72℃10min；其中在miRNAqPCR反应中，正反向引物浓度范围为100nM～500nM，PCR反应程度为95℃10min，1个循环；95℃2sec，60℃20sec，70℃10sec，40个循环。本专利技术的第六个目的是提供一种上述与脑动脉瘤相关的miRNA标志物在筛选脑动脉瘤临床干预药物中的应用。本专利技术的第七个目的是提供一种上述与脑动脉瘤相关的miRNA标志物在制备miRNA标志物基因局部缺失动物中的应用。进一步，所述miRNA标志物基因局部缺失动物通过使用选择性microRNA临床标志物基因敲除动物并繁殖而得，其中所述选择性microRNA临床标志物基因包括miR-628-3p、miR-505-5p、miR-3074-3p、miR-497-5p、miR-224-5p、miR-181b-3p和let-7b-5p中的任意一种或任意几种。进一步地，所述miRNA标志物基因局部缺失小动物作为用于筛选临床干预药物的试验动物，或者作为具有miRNA标志物基因表达降低的疾病的模型动物。进一步地，所述miRNA标志物基因局部缺失动物的制备步骤包括：1)首先对野生型小鼠进行DNA提取并测序；2)设计构建miRNA标志物基因序列的Cas9载体质粒及打靶载体；3)体外转录Cas9RNA和sgRNA；4)sg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与脑动脉瘤相关的临床标志物，其特征在于，包括miR‑628‑3p、miR‑505‑5p、miR‑3074‑3p、miR‑497‑5p、miR‑224‑5p、miR‑181b‑3p和let‑7b‑5p中的任意一种或任意几种。

【技术特征摘要】
1.一种与脑动脉瘤相关的临床标志物，其特征在于，包括miR-628-3p、miR-505-5p、miR-3074-3p、miR-497-5p、miR-224-5p、miR-181b-3p和let-7b-5p中的任意一种或任意几种。2.一种如权利要求1所述的与脑动脉瘤相关的的临床标志物在制备脑动脉瘤发病检测用试剂盒或脑动脉瘤发生诊断用试剂盒中的应用。3.一种脑动脉瘤发病检测用试剂盒或脑动脉瘤发生诊断用试剂盒，其特征在于，包括miR-628-3p、miR-505-5p、miR-3074-3p、miR-497-5p、miR-224-5p、miR-181b-3p和let-7b-5p中的任意一种或任意几种及其对应的引物。4.根据权利要求3所述的一种脑动脉瘤发病检测用试剂盒或脑动脉瘤发生诊断用试剂盒，其特征在于，所述miR-628-3p的引物序列如SEQIDNO：1所示，所述miR-505-5p的引物序列如SEQIDNO：2所示，所述miR-3074-3p的引物序列如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永东，
申请(专利权)人：李永东，
类型：发明
国别省市：上海,31