利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法技术

本发明专利技术属于免疫球蛋白制备领域，具体涉及一种利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法。本发明专利技术的方法为：将包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料移植到供体小鼠体内，经过目标抗原的免疫后，得人工淋巴结；将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内，给予目标抗原免疫刺激，获得表达目标抗体的B淋巴细胞；分离出获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。本发明专利技术的方法将人工淋巴结技术与杂交瘤细胞技术相结合，生产出大量的能产生针对特异性抗原的抗体的B淋巴细胞，获得阳性克隆的效率更高，大大提高抗体的生产效率，节省了成本。

A method of producing monoclonal antibodies by artificial lymph node technology

The present invention belongs to the field of immunoglobulin preparation, and specifically relates to a method for producing monoclonal antibodies by using artificial lymph node technology. The method is as follows: the coated stromal cells and dendritic cells in biological materials transplanted into mice after immune donor, target antigen, have artificial lymph node; artificial lymph node transplantation into immunodeficient mice, given the target antigen stimulation, expression of target antibody B lymphocyte; get separated B lymphocytes and myeloma cell fusion, acquired the monoclonal cell antibody was screened, monoclonal antibody. The method of the invention combines artificial lymph node technology and hybridoma cell technology to produce a large number of B lymphocytes that produce antibodies against specific antigens. The efficiency of obtaining positive clones is higher, and the production efficiency of antibodies is greatly improved, and the cost is saved.

【技术实现步骤摘要】
利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法
本专利技术属于免疫球蛋白制备领域，具体涉及一种利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法。
技术介绍
哺乳动物的免疫系统是最万能的生物系统，因为可以产生超过多个抗体特异性。在个体动物中，存在至少5,000-10,000个能够产生独特抗体的不同B-细胞克隆。此外，由于抗体多样性产生过程中体细胞突变的过程，本质上可以产生无限数量的独特抗体分子。实际上，当前的生物和医学研究中有许多是针对开发这个库(repertoire)。抗体的主要功能是与抗原(包括外来的和自身的)相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，尤其是单克隆抗体，由于其高度均一、针对某一特定抗原表位，因此，广泛用于免疫学分析、放射免疫显像和免疫导向治疗等领域。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲的特征，既能像骨髓瘤细胞一样在体外培养中无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来个单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体(monoclonalantibody)，简称单抗。但是这一技术的主要缺点就是体外筛选过程中，由于能分泌特异性抗体的B淋巴细胞只占极少数，因而效率较低，耗费大量的人力物力。人工淋巴结技术在2007年日本科学家TakeshiWatanabe发现的，在不具备免疫原性的生物材料上包被基质细胞和树突状细胞(DCcells)，再将包被好的材料移植到小鼠肾盂囊下，经过抗原免疫后，这些生物材料会形成包含分泌抗体的B细胞的小结节，即所谓人工淋巴结(Artificiallymphnodes)。这项技术可以使那些本来缺乏或者丧失免疫功能的小鼠重新获得部分或者全部的免疫功能，因而有着很大的应用前景。目前还没有将这一技术用于生产单克隆抗体。因此开发一种利用这一人工淋巴结技术与杂交瘤细胞技术相结合的生产方法，就能大大提高抗体的生产效率，缩短抗体生产时间。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，本专利技术的方法将人工淋巴结技术与杂交瘤细胞技术相结合，生产出大量的能产生针对特异性抗原的抗体的B淋巴细胞，获得阳性克隆的效率更高，大大提高抗体的生产效率，节省了成本。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，包括以下步骤：1)人工淋巴结的制备；2)将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内，给予目标抗原免疫刺激，获得表达目标抗体的B淋巴细胞；3)分离出步骤2)获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。本专利技术的方法将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠的体内，由于免疫缺陷型小鼠缺乏免疫性，这些移植的人工淋巴结就能够在免疫缺陷小鼠体内大量扩增，生产出大量的能产生针对特异性抗原的抗体的B淋巴细胞，大大提高抗体的生产效率，缩短抗体生产时间。人工淋巴结包含了数量巨大的针对特异性抗原的B淋巴细胞，因而在与骨髓瘤细胞融合后获得阳性克隆的效率更高，可以不必像传统方法那样通过大批量的筛选才能获得阳性克隆，从而节省了人力与物力成本。进一步，步骤1)中人工淋巴结的制备为：将包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料移植到小鼠体内，经过目标抗原的免疫后，得人工淋巴结。作为一种优选，包被到生物材料上的细胞浓度为1×107/ml。所述生物材料为天然生物材料或合成的可生物降解材料；所述天然生物材料包括但不仅限于胶原、聚糖以及生物衍生材料；所述合成的可生物降解材料包括但不仅限于聚酯类、聚乙二醇类以及聚氨基酸类。作为一种优选，所述包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料直径约为50-300um。进一步，步骤1)中生物材料的移植为移植到小鼠肾盂囊下。在不具备免疫原性的生物材料上包被基质细胞和树突状细胞(DCcells)，再将包被好的材料移植到小鼠肾盂囊下，经过抗原免疫后，这些生物材料会形成包含分泌抗体的B细胞，即所谓人工淋巴结(Artificiallymphnodes)。进一步，步骤1)中的小鼠为BALB/c小鼠；经过目标抗原的免疫分4次完成。作为一种优选，BALB/c小鼠3-6月龄，经过目标抗原免疫，每2周免疫一次，一共免疫4次。进一步，免疫前三次免疫的途径选自皮下、肌肉、腹腔或静脉注射的任一方法，最后一次加强免疫选择腹腔注射或静脉注射。作为一种优选，免疫前三次免疫的途径为皮下注射，最后一次加强免疫选择腹腔注射。步骤1)中小鼠经过免疫后，大量产生特异性抗体的B淋巴细胞会在结节处聚集并扩增，即形成了一层由产生特异性抗体的B淋巴细胞包裹的人工淋巴结。进一步，步骤2)中免疫缺陷型小鼠为SCID小鼠。所述SCID小鼠为6-8周龄SCID小鼠。进一步，步骤2)中人工淋巴结的移植为移植到免疫缺陷小鼠的肾脏。进一步，步骤2)中人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内后分两次给予目标抗原免疫刺激，18～25天后分离产生的B淋巴细胞。作为一种优选，步骤2)中人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠肾脏后，在移植后的第1天和第7天，分别给移植后的受体小鼠注射目标抗原加强免疫效果，在移植21天后，取出免疫缺陷小鼠的脾脏，分离产生的B淋巴细胞。分离B淋巴细胞与骨髓瘤细胞在PEG的作用下融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。由于免疫缺陷小鼠体内有经过初次免疫过的人工淋巴结，这些人工淋巴结在经过二次免疫时，产生B淋巴细胞和记忆细胞的速度和反应更大，因而能产生非常多的针对目标抗原的B淋巴细胞。分离出这些B淋巴细胞后，即可进行有效地细胞融合和单克隆细胞筛选。进一步，所述方法还包括步骤：4)将步骤3)中筛选的产生特异性抗体的单克隆细胞经扩增、重悬后计数，注射入小鼠腹腔产生腹水，纯化后得单克隆抗体。获得产生特异性抗体的单克隆细胞后，扩增，待细胞长至足够的量时，收取细胞，用无血清培养基重悬后计数，按照一定数量注射入小鼠腹腔，产生腹水后即可纯化单克隆抗体。进一步，所述注射入小鼠腹腔的单克隆细胞的浓度为1×107～1×108/ml，每只小鼠的注射量为0.08～0.12ml。作为一种优选，所述注射入小鼠腹腔的单克隆细胞的浓度为1×108/ml，每只小鼠的注射量为0.1ml。由于人工淋巴结技术获得的B淋巴细胞超过99％都是能产生特异性抗体的细胞，因而之后的筛选过程更加快速，基本上每轮筛选都会呈现阳性。在经过3轮筛选之后，将融合细胞按1×108/ml，每只小鼠0.1ml的量注射小鼠腹腔，产生腹水后收集腹水，纯化即可获得单克隆抗体。本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术的方法采用的人工淋巴结包含了数量巨大的针对特异性抗原的B淋巴细胞，因而在与骨髓瘤细胞融合后获得阳性克隆的效率更高，这种方法可以不必像传统方法那样通过大批量的筛选才能获得阳性克隆，从而节省了人力与物力成本。2)本专利技术的方法中在获得人工淋巴结后，这些淋巴结可以随时取出用于移植，有免疫活性的B淋巴细胞移植保持在动物体内，保证了无菌、无热源的状态，避免了在传统方法在细胞培养、冻存及复苏本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)人工淋巴结的制备；2)将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内，给予目标抗原免疫刺激，获得表达目标抗体的B淋巴细胞；3)分离出步骤2)获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)人工淋巴结的制备；2)将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内，给予目标抗原免疫刺激，获得表达目标抗体的B淋巴细胞；3)分离出步骤2)获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中人工淋巴结的制备为：将包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料移植到小鼠体内，经过目标抗原的免疫后，得人工淋巴结。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中生物材料的移植为移植到小鼠肾盂囊下。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中的小鼠为BALB/c小鼠；经过目标抗原的免疫分4次完成。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，免疫前三次免疫的途径选自皮下、...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹杰，唐勇，
申请(专利权)人：成都微康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51