免疫球蛋白结构域的工程改造制造技术

一种免疫球蛋白结构域的工程改造。本发明专利技术提供在框架区(FR)包含一个或多个非常规二硫键的单域抗体(sdAb)骨架。所述一个或多个非常规二硫键可以在通过突变引入至FR2和FR3中的半胱氨酸之间形成。在所述sdAb骨架是VH的情况下，所述Cys可以在基于Kabat编号的位置(47‑49)中的任一位置处以及位置(67‑71)中的任一位置处引入；在一个实例中，Cys可在基于Kabat编号的位置(49)和(69)处引入。在所述sdAb骨架是VL的情况下，所述Cys残基可以在基于Kabat编号的位置46‑49中的任一位置处和位置(62‑66)中的任一位置处引入；在一个实例中，所述Cys残基可以在基于Kabat编号的(位置48和64处)引入。

Engineering transformation of immunoglobulin domain

An engineering transformation of the immunoglobulin domain. The present invention provides a single domain antibody (sdAb) skeleton containing one or more unconventional two sulfur bonds in a frame area (FR). The one or more unconventional two sulfur bonds can be formed between cysteines introduced into FR2 and FR3 by mutation. In the framework of sdAb is VH, the Cys in the Kabat number based on the location (47 49) at any position and the position (67 71) introduced in any position; in one instance, Cys in the Kabat number based on the location (49) and (69) in place. In the framework of sdAb is VL, the Cys residues in Kabat number 46 at any position in position 49 and position based on (62 66) introduced in any position; in one instance, the Cys residues can be based on the Kabat number (location 48 and 64) introduction.

【技术实现步骤摘要】
免疫球蛋白结构域的工程改造本申请为分案申请，其原申请的申请日为2012年1月27日，申请号为201280016587.4，名称为“免疫球蛋白结构域的工程改造”。相关专利申请的交叉引用本申请要求享有2011年1月28日提交的美国临时专利申请USSN61/437174的优选权，其全部内容以引用的方式纳入本文。
本专利技术涉及免疫球蛋白结构域的工程改造。更具体地，本专利技术涉及对免疫球蛋白结构域进行工程改造以改善所述免疫球蛋白的生物物理特性。
技术介绍
蛋白质稳定性在蛋白质治疗中起很重要的作用，因为不稳定的蛋白质在体内会导致可变的治疗有效性以及无法预测的生理作用(Horwich,2002；Wetzel,1988；Mitraki和King,1992；Worn和Pluckthun,2001；Hurleetal.,1994)。在抗体治疗领域中，人常规抗体和抗体片段太大和/或具有较差生物物理特性，例如稳定性低、不可逆的去折叠以及表达低；因此，它们的临床应用受限。“天然存在的”单域抗体(sdAb)(例如，骆驼科(camelid)VHH、鲨鱼VNAR)不存在上述问题，但是它们因其非人的性质而是免疫原性的。全人sdAb(例如，VH或VL)由于它们具有预期的低(或缺乏)免疫原性，将会是用于人疗法的理想分子；但是，由于它们的低稳定性和溶解度，它们易于聚集(Wardetal.,1989；DaviesandReichmann,1994；DaviesandRiechmann,1995；Tanhaetal.,2001；KazlauskasandBornscheuer,2009；HolligerandHudson,2005；Hoogenboom,2005)。这限制了它们在人疗法中的应用。考虑到稳定抗体作为治疗分子的重要性，已经做出了很多努力以选出更稳定/可溶的单域抗体这一事实并不令人惊讶(DaviesandRiechmann,1996a；Jespersetal.,2004；Toetal.,2005；Tanhaetal.,2006；Arbabi-Ghahroudietal.,2009a；Arbabi-Ghahroudietal.,2009b；Arbabi-Ghahroudietal.,2010)。一种提高sdAb稳定性的典型方法是使用一种sdAb作为骨架(scaffold)来产生展示文库，所述文库包含上亿种sdAb，每种均具有独特的特异性；然后通过淘选技术选出针对靶抗原的结合物(sdAb)。在实现该方法的一种途径中，首先对亲本骨架进行工程改造以使其是非聚集性的，然后基于所述非聚集性的骨架来构建所述文库；因为假定说是文库中的子代sdAb大体上“遗传”了所述亲本骨架的非聚集特性，所以进行仅基于亲和性标准的常规淘选以选出非聚集性的sdAb。在另一种途径中，所述亲本骨架可以是非聚集性的，也可以不是非聚集性的，因此基于亲和性和非聚集标准来对其文库进行淘选。不管是哪种途径，聚集性的和非聚集性的sdAb经常被一起选出来(co-selected)；在很多情况下，聚集性的sdAb在筛选过程中占主导，或者所选的结合物具有低溶解性、稳定性和表达水平。此外，在亲和筛选的过程中，很多VH抗体丢失，其中出现大范围的氨基酸取代使VH去稳定化，导致了聚集(KazlauskasandBornscheuer,2009；Bloometal.，2006)。这些因素使得非聚集性的sdAb的筛选是令人厌倦且劳动密集型的，并且有时是令人气馁的。因此，本领域仍然需要非聚集性的、可溶且稳定的抗体。
技术实现思路
本专利技术涉及免疫球蛋白结构域的工程改造。更具体地，本专利技术涉及对免疫球蛋白结构域进行工程改造以改善所述免疫球蛋白的生物物理特性。本专利技术提供了一种含免疫球蛋白骨架的组合物以及制备和使用所述组合物的方法，所述免疫球蛋白骨架在框架区(FR)内包含一个或多个非常规二硫键。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是单域抗体(sdAb)。所述免疫球蛋白骨架可以是VH；所述VH可以属于VH3家族。或者，所述免疫球蛋白骨架可以是VL；所述VL可以属于κ或λ家族。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是人的。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是人工程化(humaneered)的。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白骨架是骆驼科的。在一个实施方案中，所述骆驼科物种选自美洲鸵、羊驼和骆驼。在如上所述的免疫球蛋白骨架中，所述一个或多个非常规二硫键可以是在FR2和FR3中在通过突变引入的半胱氨酸之间形成。在所述免疫球蛋白骨架是VH的情况下，本专利技术提供了一种制备所述骨架的方法，其中所述Cys可以在基于Kabat编号的位置47-49中的任一位置处以及位置67-71中的任一位置处引入。在一个实施方案中，Cys可在基于Kabat编号的位置49和69处引入。在所述免疫球蛋白骨架是VL的情况下，本专利技术提供了制备所述骨架的方法，其中所述Cys残基可以在基于Kabat编号的位置46-49中的任一位置处和位置62-66中的任一位置处引入。在一个实施方案中，Cys残基可以在基于Kabat编号的位置48和64处引入。本文描述的免疫球蛋白骨架可以包含多肽序列，所述多肽序列包含引入至抗体可变区的框架区FR2和FR3中的至少2个非常规Cys残基。在一个实施方案中，所述多肽包含在选自VHsdAb结构域的VHFR2区域的残基47-49的位置上的Cys残基，以及在选自VHsdAb结构域的VHFR3区域的残基69-71的位置上的Cys残基。在一个实施方案中，所述多肽包含在选自VLsdAb结构域的VLFR2区域的残基46-49的位置上的Cys残基，以及在选自VLsdAb结构域的VLFR3区域的残基62-66的位置上的Cys残基。在一个实施方案中，所述多肽包含至少在VH结构域位置49上的Cys残基以及至少在VH结构域位置69上的Cys残基。在一个实施方案中，本专利技术的VH结构域包含sdAb片段。在一个实施方案中，本专利技术提供了包含本专利技术VHsdAb片段的表达文库，其中本专利技术的sdAb片段包含多种CDR序列。在一个实施方案中，选自SEQIDNO:2、4、6和8的本专利技术VHsdAb片段的CDR区域的位置是PCT公开文本WO2006/099747图1A中提供的位置，选自SEQIDNO:70至83的那些是PCT公开文本WO2006/099747图2中为相应的野生型序列所提供的位置。在一个实施方案中，所述多肽至少包含VL结构域位置48上的Cys残基和至少VL结构域位置64上的Cys残基。在一个实施方案中，本专利技术VL结构域包含sdAb片段。在一个实施方案中，本专利技术提供了包含本专利技术VLsdAb片段的表达文库，其中本专利技术的sdAb片段包含多个CDR序列。在一个实施方案中，选自SEQIDNO：10、12、14、16、18、20、22和24的本专利技术VLsdAb片段的CDR区域的位置是FIG.1B中提供的位置。在一个实施方案中，本专利技术多肽的CDR残基可以是任意合适的序列，并且可以具有非图1A和1B提供的数量的可变数量的残基。在一个实施方案中，本专利技术的免疫球蛋白多肽包含选自以下的一个或多个序列的骨架区域QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGDTVSDESMTWVRQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包含在框架区(FR)包含一个或多个非常规二硫键的免疫球蛋白骨架。

【技术特征摘要】
2011.01.28 US 61/437,1741.一种组合物，其包含在框架区(FR)包含一个或多个非常规二硫键的免疫球蛋白骨架。2.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白骨架选自VH或VL骨架，其中VH骨架在FR中包含至少一个非常规二硫键，其中所述非常规二硫键在基于Kabat编号的位置49和69处引入的半胱氨酸残基之间形成；所述VL骨架在FR中包含至少一个非常规二硫键，其中所述非常规二硫键在基于Kabat编号的位置48和64处引入的半胱氨酸残基之间形成。3.权利要求1的组合物，其中所述骨架是选自单域抗体(sdAb)、scFv、Fab、F(ab)2或成熟免疫球蛋白的较大抗体蛋白或片段的一部分。4.权利要求3的组...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·Y·金，J·坦纳，
申请(专利权)人：加拿大国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA