DNA合成的方法技术

本发明专利技术涉及用于生产包含至少一个发夹的脱氧核糖核苷酸(DNA)的体外无细胞方法、对应的DNA产物及其用途、以及在本发明专利技术的方法中有用的寡核苷酸和试剂盒。

The method of DNA synthesis

The invention relates to an in vitro cell-free method for producing a deoxyribonucleotide (DNA) containing at least one hairpin, corresponding DNA products and their uses, as well as oligonucleotides and kits useful in the methods of the invention.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA合成的方法
本专利技术涉及用于生产包含至少一个发夹的脱氧核糖核苷酸(DNA)的体外无细胞方法、对应的DNA产物及其用途、以及在本专利技术的方法中有用的寡核苷酸和试剂盒。
技术介绍
用于从开始模板扩增闭合线性DNA的体外无细胞方法已经描述在WO2010/086626和WO2012/017210中。希望提供其它方法，其可以合成闭合线性DNA，且其也允许合成其它类型的包含一个或多个发夹的DNA分子。
技术实现思路
本专利技术提供了用于合成包含一个或更多个发夹的DNA分子的方法，所述方法不需要使用任何微生物步骤来提供开始模板。所述方法也允许合成包含一个或多个发夹的环形单链DNA或双链DNA。这些产物包括这样的DNA分子：专利技术人认为其具有以前在本领域中没有描述的结构，且其具有用于宽范围的应用的优点。根据本专利技术，在体外无细胞方法中进行包含发夹的DNA分子的合成，所述方法从可以在所述方法的全部或部分中固定化至固体支持物的寡核苷酸开始。使用可以化学地合成的短模板寡核苷酸酶促地延伸所述寡核苷酸以合成所需DNA序列，从而避免使用通常需要在细菌中增殖的编码整个所需序列的大开始模板。一旦合成了所需DNA序列，它就可以以包含一个或多个发夹的单链或双链形式从固体支持物释放。有利地，用于在本专利技术的DNA分子中提供发夹的序列也会提供在DNA合成结束后合成的DNA从固体支持物的酶促释放方式。将一种寡核苷酸固定化到固体支持物上并延伸以引入所需DNA序列从而建立第一DNA链，该链进一步包含在固体支持物近侧的原核端粒酶(protelomerase)靶序列的第一部分。还在延伸的第一链中或在互补的第二链上引入原核端粒酶的靶序列的第二部分，该第二部分与其第一部分互补。然后使用所述原核端粒酶的靶序列的第一部分和第二部分在固体支持物的近侧重新建立完整原核端粒酶靶序列，使得与原核端粒酶接触然后可以从固体支持物释放合成的DNA，并在所述从固体支持物释放的DNA分子中产生发夹。在其它方面，本专利技术提供了通过建立完整原核端粒酶靶序列或能够在合成的DNA链的远侧延伸区域中形成发夹的其它序列而向产生的DNA分子添加第二闭合末端发夹。这样的能够形成发夹的序列可以包括邻近互补序列或被非互补的序列隔开的两个互补序列。在其它方面，本专利技术提供了通过建立完整原核端粒酶靶序列或能够在合成的DNA链中形成发夹的其它序列而向产生的单链DNA分子添加第三、第四、第五或更多闭合末端发夹。根据本专利技术合成的DNA分子可以用于多种应用，包括医学和诊断用途，以及用作其它DNA扩增方法的开始模板。更详细地，本专利技术提供了：在第一方面，用于生产包含所需DNA序列的脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法，所述方法包括：(a)使固定化在固体支持物上的寡核苷酸在有至少一种DNA聚合酶存在下在促进所述固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸的条件下与一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸接触以产生第一DNA链，该链包含所需DNA序列且进一步包含所述在固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列的第一部分；(b)在(a)所产生的所述第一DNA链的远侧部分中或在第二或其它链上引入包含(a)的原核端粒酶靶序列的第二部分的DNA序列，使得所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分由此建立在所述固体支持物近侧的(a)的原核端粒酶的完整靶序列；和(c)使在所述固体支持物近侧的所述完整原核端粒酶靶序列在促进所述靶序列的切割和重连的条件下与原核端粒酶接触，由此从固定释放产生的DNA。在一个实施方案中，所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分是在序列上互补的。在另一个方面，本专利技术涉及包含固定化的寡核苷酸的固体支持物，所述寡核苷酸包含原核端粒酶的靶序列的第一部分。在另一个方面，本专利技术涉及试剂盒，其包含含有原核端粒酶的靶序列的第一部分的寡核苷酸、一系列模板寡核苷酸和任选的关于在本专利技术的方法中使用的说明书。在第四方面，本专利技术涉及包含一个或多个发夹的单链环形DNA，所述发夹中的至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分。在第五方面，本专利技术涉及包含第一发夹和第二发夹的线性共价闭合双链DNA，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹具有不与所述第一发夹互补的序列。在一个实施方案中，这由包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分的第二发夹实现，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一个替代实施方案中，这由包含能够形成发夹的序列的第二发夹实现。这样的序列可以包括能够彼此退火的邻近的或分离的互补序列。在第六方面，本专利技术涉及用于扩增DNA的体外无细胞方法，所述方法包括使单链环形DNA模板在有一种或多种引物存在下在促进所述模板扩增的条件下与至少一种DNA聚合酶接触，所述DNA模板包含含有原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹。在第七方面，本专利技术涉及用于生产线性共价闭合脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法，所述方法包括：(a)使包含第一发夹和第二发夹的线性共价闭合双链DNA在促进DNA扩增的条件下与DNA聚合酶接触，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，和(b)使所述扩增的DNA在促进线性共价闭合DNA的产生的条件下与所述第一和第二原核端粒酶接触，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在第八方面，本专利技术涉及包含至少一个发夹的单链环形DNA，所述发夹含有原核端粒酶的靶序列的一部分，所述DNA用于用在治疗或诊断中，特别是用于用在治疗人或动物体的方法中，或用在在人或动物体上实施的诊断方法中。在第九方面，本专利技术涉及包含至少一个发夹的线性共价闭合双链DNA，所述发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，且其中第二发夹的序列不与第一发夹的序列互补，所述DNA用在治疗或诊断中，特别是用于用在治疗人或动物体的方法中，或用在在人或动物体上实施的诊断方法中。在一个实施方案中，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一个替代实施方案中，所述第二发夹由邻近的或分离的互补序列提供。在第十方面，本专利技术涉及治疗人或动物体的方法，所述方法包括给有此需要的人或动物施用治疗有效量的包含发夹的单链环形DNA，所述发夹含有原核端粒酶的靶序列的一部分。在第十一方面，本专利技术涉及治疗人或动物体的方法，所述方法包括给有此需要的人或动物施用治疗有效量的包含至少一个发夹的线性共价闭合双链DNA，所述发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，且其中第二发夹的序列不与第一发夹的序列互补。在一个实施方案中，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一个替代实施方案中，所述第二发夹由邻近的或分离的互补序列提供。在从属权利要求中限定了任选的特征。下面描述了其它优点。附图说明图1a至1c：描绘了可以作为开始和/或终止引物和模板起作用的各种单链寡核苷酸的实例的图示。每个以线性形式显示或具有在原核端粒酶靶序列的部分中形成的发夹(101或107)，且具有游离的3’(102)和5’(103)末端。图1a描绘了可以用作开始引物或用作末端寡核苷酸模板和引物的寡核苷酸(100)。所述寡核苷酸含有原核端粒酶靶序列的部分(101)，其侧接不会形成原核端粒酶靶序列的序列部分的3’序列(104)和5’序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产包含所需脱氧核糖核酸(DNA)序列的DNA的体外无细胞方法，所述方法包括：(a)使固定化在固体支持物上的寡核苷酸在有至少一种DNA聚合酶存在下、在促进所述固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸的条件下与一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸接触以产生第一DNA链，该链包含所需DNA序列且进一步包含在固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列的第一部分；(b)在(a)中产生的所述第一DNA链的远侧部分中或在第二链上引入包含(a)的原核端粒酶靶序列的第二部分的DNA序列，使得所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分由此建立在所述固体支持物近侧的(a)的原核端粒酶的完整靶序列；和(c)使在所述固体支持物近侧的所述完整原核端粒酶靶序列在促进所述靶序列的切割和重连的条件下与原核端粒酶接触，由此释放产生的固定化的DNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.17 GB 1502645.31.一种生产包含所需脱氧核糖核酸(DNA)序列的DNA的体外无细胞方法，所述方法包括：(a)使固定化在固体支持物上的寡核苷酸在有至少一种DNA聚合酶存在下、在促进所述固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸的条件下与一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸接触以产生第一DNA链，该链包含所需DNA序列且进一步包含在固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列的第一部分；(b)在(a)中产生的所述第一DNA链的远侧部分中或在第二链上引入包含(a)的原核端粒酶靶序列的第二部分的DNA序列，使得所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分由此建立在所述固体支持物近侧的(a)的原核端粒酶的完整靶序列；和(c)使在所述固体支持物近侧的所述完整原核端粒酶靶序列在促进所述靶序列的切割和重连的条件下与原核端粒酶接触，由此释放产生的固定化的DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)的固定化的寡核苷酸包含原核端粒酶靶序列的第一部分。3.根据权利要求1所述的方法，其中将原核端粒酶靶序列的第一部分通过模板依赖性延伸引入第一DNA链中。4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，所述方法用于生产包含一个或多个发夹的单链环形DNA，至少一个发夹包含原核端粒酶的靶序列的一部分。5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤b)包括使用一种或更多种模板寡核苷酸的模板依赖性延伸，以在第一DNA链的远侧端部引入特定序列，所述特定序列与位于固体支持物近侧的第一DNA链的序列互补，并且所述互补序列的退火形成单链DNA环。6.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括模板依赖性延伸，以在第一DNA链的远侧端部引入与(a)的原核端粒酶的所述靶序列的第一部分的3’侧接区域中的序列互补的序列。7.根据权利要求5或6所述的方法，所述方法包括模板依赖性延伸，以在第一DNA链的远侧端部引入(a)的原核端粒酶的靶序列的第二互补部分和任选的与(a)的原核端粒酶的靶序列的第一部分的5’侧接区域中的序列互补的序列。8.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，所述方法还包括所述DNA环的3’末端的模板依赖性延伸，以建立在所述固体支持物近侧的所述完整原核端粒酶靶序列。9.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使用一种或多种模板寡核苷酸的模板依赖性延伸，以在第一DNA链的远侧端部引入两个互补序列区域，所述互补序列区域能够退火在一起以形成发夹。10.根据权利要求9所述的方法，其中两个互补序列区域分别是原核端粒酶的靶序列的第一部分和与其第一部分互补的所述原核端粒酶的靶序列的第二部分，以由此建立在所述固体支持物远侧的完整原核端粒酶靶序列。11.根据权利要求9或10所述的方法，所述方法用于生产包含至少两个发夹的单链环形DNA，所述发夹中的至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分，所述方法包括用一系列模板寡核苷酸对在第一链的远侧端部处的发夹进行的模板依赖性延伸以建立第一DNA链的第二段，其中所述系列包含在序列上重叠以形成与所述第一链的至少一部分不互补的序列的模板寡核苷酸和包含(a)的原核端粒酶的靶序列的第二部分的模板寡核苷酸，以由此建立在所述固体支持物近侧的完整原核端粒酶靶序列。12.根据权利要求9或权利要求11所述的方法，其中通过使用一种或更多种引入自互补序列的模板寡核苷酸的延伸而在第一链中包括两个互补序列。13.根据权利要求1至3任一项所述的方法，所述方法用于生产线性共价闭合双链DNA，所述方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·罗斯韦尔，尼尔·波特，L·瓦伊尼，T·艾迪，
申请(专利权)人：塔驰莱特IP有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB