把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法及其试剂盒技术

本发明专利技术通常涉及一种生物分子分析方法，更具体地说，本发明专利技术涉及一种为了支援生物分子的临床决策而利用用于精度管理及测定的标准物质针对一个或一个以上的生物分子以核酸分析技术予以分析的配体‑核酸分析方法、试剂盒、装置及系统以及利用它的临床决策支援系统。

An analytical method for the use of an external biomolecule as a standard substance and its kit

The present invention relates generally to a molecular biological analysis method, more specifically, the invention relates to a clinical decision support for biological molecules and use for precision management and determination of the standard material for one or more of the biological molecules in nucleic acid analysis technique to analysis the ligand nucleic acid analysis method and kit device and system, and the use of clinical decision support system for it.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种基于核酸分析的生物分子的分析方法及其试剂盒。
技术介绍
生物分子是构成生物样本的众多蛋白质、核酸、脂质及碳化物之类的物质，分析该生物分子的技术以及把生物样本中生物分子的量化状态的综合信息，亦即，生产生物分子的多重检查的技术得益于物理学、生物化学及生物信息学的发达而被广泛地开发，但是因为现有方法或器材的使用、维护费、轻易性、正确度、灵敏度、检查时间及过程的自动化等问题而非常需要开发出高效的新方法及器材。生物分子分析及多重检查技术本身并不是终极目标而只是实现目标的一个手段，但由于能够有效地应用于微生物、细胞、组织等处而广泛应用于医学、兽医学、环境工程学、食品工程学、农业等。目前已可利用物理及化学性质通过各种方法制备含有构成生物样本组织、细胞块、细胞及微生物等的蛋白质及有机物质等的生物分子分析及表达谱(profile)利用生物样本所含生物分子分析及分析结果分析生物学意义的临床决策支援系统(ClinicalDecisionSupportSystem)是一种在医生对患者进行诊疗时帮助医生对诊断治疗进行决策(DecisionMaking)的过程的系统。临床决策支援系统主要包括基于案例的机器学习推理系统(CaseBasedMachineLearningInferenceSystem)与专家系统(ExpertSystem)。基于案例的机器学习推理系统收集已经判定了疾病的患者们的临床信息(ClinicalInformation)及生物学信息(亦即，生物分子分析结果数据)后以“机器学习”方式根据已知临床信息与生物学信息等信息对疾病进行推理或判别。专家系统则利用医学专家事先赋予的规则(Rule)诊断疾病。近来还利用生物分子多重检查的典型技术(亦即，针对蛋白体的并联高速分析(HighThroughputScreening)技艺)开发了蛋白质芯片(Proteinchip)或适体芯片(Aptamerchip)(Smithetal.,MolCellProtomics,11-18.2003及McCauleyetal.,AnalBiochem,319(2)、244-250.2003)后正在使用中。该并联高速分析上使用的支持体有玻片(glassslide)、生物传感器的侦测表面、有空小珠(bead)、纳米粒子等。而且，对多重检查进行分析后确定有用的生物分子并且将其予以分离，然后利用MALDI-TOF(MatrixAssistedLaserDesorption/Ionization-TimeOfFlight)等确认其组成成分。近来则利用SELDI-TOFMS(Surface-enhancedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)对蛋白质表达谱(proteinprofile)进行了很多研究(Adametal.,CancerResearch,62,3609-3614.2002；Lietal.,ClinicalChemistry,48,1296-1304.2002；andPetricoinetal.,TheLancet,359,572-577.2002)。还开发了另一种解决方法，亦即，利用DNA与核酸聚合酶(polymerase)把信号加以扩增的技术immuno-PCR(IPCR)方法(Sanoetal.,Science258,120-122.1992)。如前所述，生物分子分析方法在提高检测灵敏度及提升多重分析能方面有了巨大进步，但是依然在用于质量控制及测定的标准物质、分析成本的降低、分析时间的缩短、灵敏度的提高及重现性的增强之类的技术课题需要解决。
技术实现思路
解决的技术课题本专利技术旨在解决上述现有的生物分子分析技术的问题，本专利技术人为了开发出以经过改善的效率及灵敏度对生物分子进行实时分析的技术而努力研究的结果，成功开发了把外部生物分子作为标准物质使用并且通过核酸分析单凭一次检查就能把一个以上的生物分子予以定量分析的方法，凭此，可实现本专利技术的目的。解决课题的技术方案为了达到上述目的，本专利技术的一实施形态揭示了基于核酸分析的生物分子的分析方法。本专利技术的基于核酸分析的生物分子的分析方法包括下列步骤：(a)备妥存在一个以上靶标生物分子的生物样本或其加工样本；(b)添加特异性结合于上述靶标生物分子的配体与设计核酸的连接结构物，形成生物分子与其特异性连接结构物的复合体；(c)把上述复合体予以分离；(d)把上述复合体的设计核酸予以扩增；(e)针对该扩增产物进行分析而获得对于靶标生物分子的定性或定量信息；上述设计核酸是一种具备下列领域的设计核酸，下列领域为，正向引物结合的领域、逆向引物结合的领域、以及在该领域之间把配体特异性结合的分子表达而得以识别该分子的领域。由于上述设计核酸包含了能够把所连接的配体特异性结合的分子予以表达(represent)的领域，因此确定该设计核酸扩增子的存在与否及/或存在量(亦即，扩增量)(准确地说，确定表达配体特异性结合的分子的领域的扩增子的存在与否及/或存在量(亦即，扩增量))就能对连接到该设计核酸的配体所特异性结合的分子进行定性分析(亦即，确定存在与否)或定量分析(亦即，能相对或绝对地确定存在量)。在此，表达配体特异性结合的分子的领域指的是下列领域，亦即，当配体特异性结合的分子不同时，与其相应地进行不同设计的领域。该设计只要是能够检测该不同就不限制到底如何设计，但通常以改变碱基序列或其长度地实现。即使拟分析的生物分子为两个以上时，本专利技术的方法也能据此添加能够和该各个生物分子进行特异性结合的配体与设计核酸的连接结构物，然后使用一个由正向引物和逆向引物组成的组以多重聚合酶链式反应(realtimemultiplexPCR)等予以扩增的话，就能单凭一次扩增过程(亦即，单凭一次检查或着在一个管里)同时对上述两个以上的靶标生物分子予以定性及/或定量分析。在此，设计核酸即使所结合的配体不同并且连带地使其配体认知相异的生物分子后结合，其正向引物结合的领域和其逆向引物结合的领域被设计成在一切配体与设计核酸的连接结构物之间具备共同序列，因此一切连接结构物的设计核酸可以由一个由正向引物和逆向引物组成的组扩增。在本专利技术的方法中，配体与设计核酸的连接结构物可以把配体与设计核酸共价或非共价结合后获得。该结合可以使用本
所公知的任何方法。例如，如本专利技术的实施例所示，在设计核酸的5'末端引进胺基后共价结合到配体(作为蛋白质的抗体)，或者以蛋白生物素(Biotin)与抗生物素蛋白(avidin)为媒介(配体结合蛋白生物素而设计核酸结合抗生物素蛋白)非共价地进行结合。在本专利技术的方法中上述生物样本的加工样本指的是，生物样本为血液时将其加工后得到的血浆或血清，或者靶标生物分子为蛋白质时利用总蛋白质提取试剂等物从生物样本得到的总蛋白质样本。在本专利技术的方法中，可以使用用于相对及/或绝对定量分析的标准物质，该标准物质可以使用拟分析的样本中不存在的外部生物分子(外部标准物质)。只要是拟分析的样本中不存在的物质，该外部标准物质就能使用任意物质，例如，拟分析的样本为人来源生物样本而靶标生物分子为蛋白质时下列实施例所使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，包括下列步骤：(a)备妥存在一个以上靶标生物分子的生物样本或其加工样本；(b)把作为标准物质而不存在于该样本的一个以上的外部生物分子予以定量后添加到上述生物样本或其加工样本；(b)添加特异性结合于上述靶标生物分子或外部生物分子的配体与设计核酸的连接结构物，形成靶标生物分子或外部生物分子与其特异性连接结构物的复合体；(c)把上述复合体予以分离；(d)把上述复合体的设计核酸予以扩增；及(e)把对上述靶标生物分子的复合体的设计核酸的扩增子和对上述外部生物分子的复合体的设计核酸的扩增子予以定量并比较后获得对上述靶标生物分子的定量信息；上述设计核酸是一种具备下列领域的设计核酸，下列领域为，正向引物结合的领域、逆向引物结合的领域、以及在这些领域之间把配体特异性结合的分子表达而得以识别该分子的领域，上述设计核酸的正向引物结合的领域和逆向引物结合的领域在一切设计核酸具备共同碱基序列以便以一个由正向引物和逆向引物组成的组扩增一切设计核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.20 KR 10-2015-00552271.一种把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，包括下列步骤：(a)备妥存在一个以上靶标生物分子的生物样本或其加工样本；(b)把作为标准物质而不存在于该样本的一个以上的外部生物分子予以定量后添加到上述生物样本或其加工样本；(b)添加特异性结合于上述靶标生物分子或外部生物分子的配体与设计核酸的连接结构物，形成靶标生物分子或外部生物分子与其特异性连接结构物的复合体；(c)把上述复合体予以分离；(d)把上述复合体的设计核酸予以扩增；及(e)把对上述靶标生物分子的复合体的设计核酸的扩增子和对上述外部生物分子的复合体的设计核酸的扩增子予以定量并比较后获得对上述靶标生物分子的定量信息；上述设计核酸是一种具备下列领域的设计核酸，下列领域为，正向引物结合的领域、逆向引物结合的领域、以及在这些领域之间把配体特异性结合的分子表达而得以识别该分子的领域，上述设计核酸的正向引物结合的领域和逆向引物结合的领域在一切设计核酸具备共同碱基序列以便以一个由正向引物和逆向引物组成的组扩增一切设计核酸。2.根据权利要求1所述的把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，上述(e)步骤中针对靶标生物分子得到定量信息的步骤还包括下列步骤，把上述靶标生物分子和其连接结构物的结合亲和性与上述外部生物分子和其连接结构物的结合亲和性之间的差异予以反映。3.根据权利要求2所述的把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，上述反映步骤包括下列(i)到(vi)步骤：(i)把上述靶标生物分子和上述外部生物分子予以定量后备妥以同一浓度将其包含的对照样本；(ii)添加特异性结合于上述对照样本的经过定量的靶标生物分子或经过定量的外部生物分子并且和上述(c)步骤所用连接结构物相同的连接结构物，形成上述靶标生物分子和其特异性连接结构物的复合体与上述外部生物分子和其特异性连接结构物的复合体；(iii)把上述复合体予以分离；(iv)把上述复合体的设计核酸予以扩增；(v)求取对上述靶标生物分子的扩增子和对上述外部生物分子的扩增子的差异；及(vi)把上述差异反映到上述(e)步骤的靶标生物分子的定量信息。4.根据权利要求3所述的把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，前述一切扩增以能够实时检测其扩增子的实时聚合酶链式反应实现，该扩增子的量以Ct(Thresholdcycle)值算出，上述(e)步骤的定量比较的结果以△Ct-n(Ct靶标生物分子-Ct外部生物分子)算出，上述(e)步骤的靶标生物分子的定量信息以上述(a)步骤的外部生物分子的浓度×2-△Ct-n算出，上述(v)步骤的差异以△Ct-c(Ct对照样本的生物分子-Ct对照样本的外部生物分子)算出，因此上述(vi)步骤反映上述△Ct-n与△Ct-c的差异值△Ct-cal(△Ct-n-△Ct-c)，让上述(e)步骤的靶标生物分子的定量信息以上述(a)步骤的外部生物分子的浓度×2-△Ct-cal确定地实行。5.根据权利要求1所述的把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，上述样本中的靶标生物分子为2种以上，因此，其生物分子的特异配体与设计核酸的连接结构物也是2种以上，在上述2种以上的连接结构物的设计核酸中其正向引物结合的领域和其逆向引物结合的领域不论其种类地在一切连接结构物的设计核酸之间具备共同碱基序列。6.根据权利要求1所述的把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，上述生物分子是蛋白质或糖蛋白，上述配体是抗体。7.根据权利要求1所述的把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，上述设计核酸是单链DNA或单链RNA，表达上述配体特异性结合的分子的领域是以碱基序列或其长度表达的领域。8.根据权利要求1所述的把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，上述扩增技术由聚合酶链式反应(PCR)、实时聚合酶链式反应(realtimePCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时逆转录聚合酶链式反应(realtimeRT-PCR)、多重聚合酶链式反应(multiplexPCR)、实时多重聚合酶链式反应(realtimemultiplexPCR)及多重逆转录聚合酶链式反应(multiplexRT-PCR)中的一个聚合酶链式反应实现。9.根据权利要求1所述的把外部生物分子作为标准物质使用的生物分子的分析方法，其特征在于，上述(c)步骤的扩增由选自实时聚合酶链式反应(realtimePCR)、实时逆转录聚合酶链式反应(realtimeRT-PCR)、实时多重聚合酶链式反应(realtimemultiplexPCR)及实时多重逆转录聚合酶链式反应(realtimemultiplexRT-PCR)所组成的群的聚合酶链式反应实现，进行上述扩增时添加Taqman探针(Taqmanprobe)而得以利用该Taqman探针把该扩增子予以定量。...

【专利技术属性】
技术研发人员：金圣千，
申请(专利权)人：金圣千，
类型：发明
国别省市：韩国,KR