闭合线性DNA的生产制造技术

本发明专利技术涉及闭合线性DNA的生产，具体而言，本发明专利技术涉及用于生产闭合线性脱氧核糖核酸(DNA)的改良方法，尤其是用于在无细胞下酶促生产闭合线性DNA分子，优选使用闭合线性DNA作为DNA合成的模板。本发明专利技术还涉及新型的闭合线性DNA物质，其适合作为模板用在生产闭合线性DNA的改良方法中。另外，本发明专利技术还涉及所述方法的中间产物，原因是这能够使由模板生产的闭合线性DNA的数量大于现有技术已知的方法。线性DNA的数量大于现有技术已知的方法。线性DNA的数量大于现有技术已知的方法。

【技术实现步骤摘要】
闭合线性DNA的生产
[0001]本申请是申请号为2017800637882，申请日为2017年8月16日，专利技术名称为“闭合线性DNA的生产”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及用于生产闭合线性脱氧核糖核酸(DNA)的改进方法,特别是用于无细胞的酶促生产闭合线性DNA分子，优选使用闭合线性DNA作为DNA合成模板。本专利技术还涉及新型的闭合线性DNA物质，适于作为模板用在生产闭合线性DNA的改进方法中。此外，本专利技术还涉及所述方法的中间产物，原因是这能够使由模板生产的闭合线性DNA的数量大于现有技术已知的方法。

技术介绍

[0003]申请人以前曾在WO201/086626和WO2012/017210中描述过闭合线性DNA的无细胞生产；这些文件在此以引用方式并入。这些申请中描述的方法涉及使用DNA模板生产在每一端共价闭合的线性双链DNA(闭合线性DNA)，其中DNA模板包括至少一个原核端粒酶(protelomerase)识别序列，并且其中模板使用至少一个DNA聚合酶进行扩增且使用一个原核端粒酶进行加工，以产生闭合的线性DNA。闭合线性DNA的闭合端各包括原核端粒酶识别序列的一部分。在列出的申请中包括使用闭合线性DNA作为模板，并且使用这种模板是有利的，因为这意味着在生产过程中浪费的试剂数量最少。通过使用这些方法，闭式线性DNA的小规模实验生产与闭合线性DNA模板配合得很好。然而，产量低于预期，且不足以制备商业上可行的闭合线性DNA量。
[0004]在上述方法中使用闭合线性DNA模板时，闭合线性DNA分子可被视为单链环形分子，如图5所示。通常情况下，本文所述的闭合线性DNA在序列上基本上是完全互补的，尽管结构可能会容忍一些微小的变异或"摇摆"。因此，闭合线性DNA在序列上可能至少为95％互补，或至少为96、97、98、99或100％互补。变性时，它实际上是一个圆形分子，包含彼此相邻的正向链(正义链或正链)和反向链(反义链或负链)两条链。这与质粒DNA形成对比，在后者之中互补序列(正链和负链)位于不同的圆形链上(图5中A与B相比)。
[0005]闭合线性DNA的独特结构意味着它比质粒更容易复性，因此用DNA聚合酶进行DNA扩增的寡核苷酸启动可能会带来更多的挑战。在使用的单引物结合到发夹内包含原核端粒酶识别序列的回文序列的情况下，尤其如此。闭合的线性DNA模板可以使用链置换聚合酶进行扩增，所述聚合酶启动产生包含DNA单链的串联体(concatamer)，每个串联体包含DNA模板的多个重复单元，每个重复单元在序列上与闭合线性DNA模板的原始序列互补。然而，由于每个模板都包括正、负链，因此产生的串联体单链DNA包括作为"重复单元"的交替负链和正链序列。这可以与质粒的扩增进行比较，在质粒中，从环形模板(任一条链)产生的单链包括相反方向上同一序列的多个重复(即正义链复制为包含反义链的多个重复单元的串联体)。因此,作为质粒DNA模板和闭合线性DNA模板的链置换复制的结果而产生的串联体产物存在明显的结构差异。正是闭合线性DNA扩增产物的这些结构差异可能导致了闭合线性DNA
的产生效率低。
[0006]由于最初由闭合线性DNA扩增而产生的串联体是DNA的单链，因此理论上它们可作为模板用于进一步引物结合和进一步复制。此步骤生成具有两个不同互补链的串联体，然后每条链均可能被置换以复制更多的新链。因此，"双链的"串联体包含DNA的两个不同的互补链。理论上，由于所使用的链置换聚合酶的性质，大量的扩增可能会从少量的初始模板产生。双链DNA串联体是重要的，因为这最终是在制备闭合线性DNA过程中使用的原核端粒酶的底物，如WO2010/086626和WO2012/017210等先前申请中所述。
[0007]然而，专利技术人已经确定，当闭合线性DNA被用作模板时，部分或大部分"产物"是作为DNA纳米花形成的，尽管舔加了原核端粒酶来切割双链串联体中的完整原核端粒酶识别序列并形成闭合线性DNA。这显示在图6中。包含交替的"正链"和"负链"的单链DNA实际上是自身互补的，因此很容易在内部折叠到被称为DNA纳米花的致密结构中。这些本质上是串联体DNA的长单链，其自身杂交，并且不再可用于利用原核端粒酶的启动或加工，因为链紧密地堆积在一起。这远远不是理想情况。闭合线性DNA生产的标准方法所需的是使用初始单链串联体DNA作为模板生产线性双链串联体，并且这种双链中间体可由原核端粒酶加工而成闭合线性DNA分子(图5中的步骤k)。完整的原核端粒酶识别序列由DNA的两条互补链以双链形式形成。
[0008]在闭合的线性DNA模板上作用的链置换聚合酶产生的DNA的初始单链的相邻正
‑
负性质导致串联体的广泛内部杂交，以产生DNA纳米花(图6，步骤F)。这种紧凑的折叠DNA结构阻止了高效的寡核苷酸引物结合(图6，步骤G)，而这是本领域现有方法所使用的将DNA纳米花转化为原核端粒酶能加工的线性双链串联体所必需的。
[0009]因此，需要一个改进的体外方法，以高DNA产量高效地扩增闭合的线性DNA模板，或者可选地以减少在闭合线性DNA的生产过程中产生的难以逾越的DNA纳米花，和/或增加已经形成的DNA纳米花转化为闭合的线性DNA。
[0010]专利技术概述
[0011]本专利技术涉及一种从闭合线性DNA模板体外无细胞生产闭合线性DNA的方法。与当前的方法相比，所述方法可以增强闭合线性DNA的生产。这显著提高了生产率，同时降低了生产闭合线性DNA的成本，特别是在更大的规模生产时。
[0012]因此，提供了一种无细胞生产闭合线性DNA分子的方法，所述方法包括：
[0013](a)在至少一种引物存在下，使模板与链置换聚合酶在促进所述模板扩增的条件下接触，所述模板包含在每一端通过原核端粒酶识别序列的一部分共价闭合的线性双链DNA分子，并且包含至少一个茎环基序，所述引物能够特异性结合在所述茎环基序内部的引物结合位点；
[0014](b)在促进闭合线性DNA生产的条件下，使(a)中产生的DNA与至少一种原核端粒酶接触。
[0015]任选地，该模板可以包含进一步的原核端粒酶识别序列，此外还可以包含位于闭合线性DNA模板的闭合端或帽上的原核端粒酶识别序列的那些部分。如果模板包含一个或多个额外的或进一步的原核端粒酶识别序列，则可将额外的原核端粒酶识别序列置于模板双链段的任何位置。优选地，这些额外的或进一步的原核端粒酶识别序列不同于至少一个茎环基序，并且与之分开。通过至少一个茎环基序，可以将额外的原核端粒酶识别序列与闭
合线性DNA的一个或两个闭合端分开。
[0016]任选地，每个原核端粒酶识别序列或其部分可以是相同的序列或不同的序列，每个序列独立于另一个序列。不同的原核端粒酶将对不同的识别序列产生作用，并且因此生产闭合线性DNA需要适当的原核端粒酶。
[0017]根据第二个方面，本专利技术涉及一种在各端被原核端粒酶识别序列的部分共价闭合的线性双链DNA分子，其中所述线性双链DNA分子的序列包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无细胞生产闭合线性脱氧核糖核酸(DNA)分子的方法，所述方法包括：(a)在至少一种引物存在下，使模板与链置换聚合酶在促进所述模板扩增的条件下接触，所述模板包含在每一端通过原核端粒酶识别序列的部分共价闭合的线性双链DNA分子，并且还包含至少一个茎环基序，所述引物能够特异性结合在所述茎环基序内的引物结合位点；(b)在促进闭合线性DNA生产的条件下，使(a)中生产的DNA与至少一种原核端粒酶接触。2.如权利要求1所述的方法，其中所述茎环基序的序列包含被两条序列侧接的中心段。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中茎环基序的中心段的序列包含引物结合位点，其任选地与相邻序列形成中心段的部分。4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中形成茎环基序的所述序列相邻于或者接近于模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：塔驰莱特IP有限公司，
类型：发明
国别省市：