自靶向性表达载体制造技术

本发明专利技术涉及可用于多种应用的新核酸分子及其制备方法。这些核酸分子优选是DNA载体，任选是DNA表达载体。所述核酸分子由于本身具有一个或多个特异性结合基序而能够将载体靶向特定的细胞位置，例如细胞核。因此，本发明专利技术的核酸分子也可以被描述为靶向性递送载体，尤其是自靶向性递送载体或智能递送载体。自靶向性递送载体或智能递送载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】自靶向性表达载体
专利

[0001]本专利技术涉及可用于许多应用的新核酸分子及其制备方法。这些核酸分子优选是DNA载体，任选地是DNA表达载体。所述核酸分子由于自身内存在一个或多个特异性结合基序而能够将所述载体靶向特定的细胞位置，例如细胞核。因此，本专利技术的核酸分子也可以描述为靶向性递送载体，特别是自靶向性递送载体或智能递送载体。因此，这些构建体可以被描述为靶向性的，因为它们能够有效地将载荷递送到需要表达的位置。本专利技术还涉及一种制备载体的独特方法。本专利技术的载体可以是闭合的，即没有任何自由末端，或者它可以是开口的，其中末端核苷酸在所述载体内碱基配对但不相互连接。有效地公开了一种具有允许载体靶向目标位置的至少一个“粘性末端”的载体。
[0002]专利技术背景
[0003]将遗传物质引入细胞的原因有多种，包括为了补偿或纠正异常基因或为了产生有益蛋白。如果突变基因导致关键蛋白的缺失或突变，则需要引入所述基因的正常拷贝以恢复细胞功能。此外，期望引入的是编码活性RNA实体的遗传物质而不是肽。
[0004]遗传物质如基因一般不直接用于治疗。它包含在用于递送至细胞的载体中。可以通过多种方法将遗传物质递送到细胞中。某些病毒经常被用作载体，因为它们可以通过感染细胞来递送遗传物质。也使用裸DNA或DNA复合物(非病毒载体)。
[0005]非病毒载体与病毒载体相比具有某些优势，例如生产规模更大和宿主免疫原性低。然而，非病毒载体如质粒可产生较低水平的转染和表达，从而功效较低。传统的非病毒载体如质粒也可以在细菌中扩增，这意味着具有感染遗传物质的可能性，如下文更详细的讨论。
[0006]非病毒载体，例如质粒和小环，可能面临巨大的递送障碍，特别是如何将核酸送至正确的细胞，使其进入细胞，并根据需要进一步进入细胞核或其他细胞内位置。将遗传物质有效转移到细胞中存在许多屏障，包括细胞外基质、内体/溶酶体环境、内体膜和核膜。
[0007]核输入是真核细胞中基因表达的一个众所周知的瓶颈，并且相对小部分的转染DNA被转运至细胞核。
[0008]已采用多种策略，包括将非病毒载体加上标签肽如核定位信号或序列(NLS)。双链DNA核靶向性序列(DTS)的使用也增加了载体定位于细胞核的能力，但这些包含在双链体内，不是本文所述的结合基序。此外，DNA已与具有表面功能化的脂质体复合，以试图进行靶向。脂质体的使用并非没有限制，因为阳离子脂质的毒性可导致不能全身递送。
[0009]靶向递送系统通常包括感兴趣的DNA、聚阳离子(通常是聚赖氨酸或阳离子脂质)和与聚阳离子缀合的靶向性配体。然而，DNA有可能在循环期间与靶向性配体分离。此外，需要将功能结构域与DNA直接缀合，同时保持DNA的活性。例如，当NLS与质粒缀合时，已证明质粒的核吸收显著增加。然而，由于使用的缀合方法，质粒在缀合后丧失其表达活性(Sebestyen等,Natl.Biotech.,16(1998),pp.80
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85)。因此，缀合可导致DNA表达的减少。
[0010]化学靶向递送的附加条件是DNA载体的特征，包括病毒衍生的ITR。例如，WO2019/143885中描述的无衣壳AAV载体包括病毒衍生序列，例如ITR序列，使用WO2019/051289中描
述的脂质纳米颗粒递送系统递送。类似地，WO2019/246544描述了具有病毒衍生的ITR的载体，其依赖于次级试剂来靶向DNA载体。
[0011]如果没有靶向性，则需要远远更大量的载体才能确保达到预期效果，因为有很多载体在到达期望目的地之前丢失。因此希望能够减少提供的载体量。
[0012]然而，用肽、实际上是蛋白和其他小分子标记DNA可能具有挑战性，这意味着载体将包含额外的实体。更为期望的是提供一种―一体化(all in one)”或最小方案，它允许特异性靶向的同时不需要为了靶向而在载体上加额外的标签实体。因此，用于靶向递送的单一单元很有吸引力。
[0013]本领域通常使用的核酸分子，例如衍生自病毒基因组的基因递送载体可能存在问题，因为它们可能在基因递送载体的接受者中诱导免疫应答，这是因为免疫系统能够识别循环的―外来”DNA。此类基因递送载体可具有病毒序列，例如反向末端重复(ITR)，这可能会激发先天免疫系统并募集抑制载体表达的DNA修复酶。如果DNA是在细菌细胞中产生的，则它将具有原核模式的DNA甲基化，这可能在真核生物中被识别为外来物，并同样被拒绝。例如，质粒(pDNA)是天然存在的环状dsDNA分子，是从一代稳定遗传到下一代的额外染色体DNA片段。质粒及其衍生物已被用作基因递送载体，并取得了不同程度的成功。
[0014]生产核酸载体的方法也可能存在问题。在细菌细胞内制备核酸分子的风险是最终产品被脂多糖(LPS)、内毒素和其他原核生物特异性分子污染。这些分子具有在真核生物中产生免疫应答的能力，因为它们是微生物病原体的有效指示物。事实上，在任何基于细胞的系统中制造核酸载体都会具有最终产品中存在来自细胞培养的污染物的风险，这些污染物包括来自宿主细胞的基因组材料。在细胞内生产核酸效率低，因为生产核酸需要提供比合成方法远远更多的物质。除了成本问题外，在许多情况下使用细胞培养可能对扩增过程的再现性造成困难。在复杂的细胞生化环境中，难以控制所需核酸产物的质量和产量。处理可能对核酸在其中扩增的细胞有毒的序列也很困难。重组事件也可能对可靠生产目标核酸造成问题。
[0015]DNA可以在不使用细胞的情况下合成产生。寡核苷酸可以通过使用修饰的核苷酸延伸链来化学合成。这些构建模块(building block)的制备需要付出一定的代价。每个核苷酸的逐步添加是一个不完美的过程(每条链被延伸的几率被称为―偶联效率”)，并且对于较长序列，大多数启动的链将不会成为正确的全长产物。这阻碍了长序列的大规模生产——这些方法始终在长度、准确性和规模之间必需存在牺牲。此类寡核苷酸的主要用途仍在几百个核苷酸范围内(例如，引物和探针)，最大准确长度被认为在300个核苷酸左右的长度。通常，合成的寡核苷酸是长度为约15
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25个碱基的单链核酸分子。
[0016]合成方法的优选替代方法是依赖于模板的核酸的酶促生产。用于合成核酸的无细胞体外酶促方法避免了使用任何宿主细胞的需求，因此是有利的，尤其是当生产需要符合良好生产规范(GMP)标准时。因此，酶促产生的核酸可以更高效地制备，并且没有细胞来源的污染物的风险。
[0017]因此，需要酶促生产和改进的构建体，它们更安全且更被接受者耐受，理想地，它们还能抵抗细胞内的立即降解。此外，期望的是这些改进的构建体是靶向性的，例如它们能够将构建体引导至特定组织或细胞类型或细胞内的特定位置(包括细胞核)。将载体靶向至目标位置是基因治疗等的目标。或者，靶向特定细菌细胞可以允许在特定细胞类型中表达
杀菌剂。类似的方法可用于其他微生物，如真菌或原生生物。
[0018]本专利技术尤其涉及一种高效且有效地制备靶向性核酸构建体的新型无细胞体外方法，还涉及靶向性构建体本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包括DNA双链部分的靶向性DNA表达载体，其特征在于，所述双链部分在两个末端加帽，其中双链体的至少一个末端用结构基序加帽，并且所述结构基序包括形成能够结合细胞靶标的构象的至少一个结合基序。2.根据权利要求1所述的靶向性表达载体，其中双链体DNA的两个末端均用结构基序加帽，所述结构基序可以是相同的或不同的。3.根据权利要求1所述的靶向性表达载体，其中双链体DNA的一个末端用结构基序加帽，另一个末端用发夹、T形发夹、横臂、茎环、环、凸起或十字形加帽。4.根据前述权利要求中任一项所述的靶向性表达载体，其中所述结构基序包括结合基序的阵列，其可以是相同的或不同的。5.根据前述权利要求中任一项所述的靶向性表达载体，其中所述结合基序能够结合以下任何一项或多项上的细胞靶标：(i)细胞表面；(ii)核膜；(iii)核运输系统；(iv)细胞区室(v)核组分；(vi)细胞质内含物；和/或(vii)细胞质蛋白或肽6.根据权利要求1至5中任一项所述的靶向性表达载体，其中所述载体还包括能够结合以下任何一项或多项的结合基序：(i)肽或蛋白；(ii)小分子；(iii)抗体或其衍生物；(iv)酶；(v)免疫刺激剂(vi)激动剂或拮抗剂；(vii)佐剂和/或(viii)核酸。7.根据权利要求5所述的靶向性表达载体，其中所述靶标存在于真核细胞中或真核细胞上，所述真核细胞任选地是植物细胞、原生生物细胞、真菌细胞、人细胞或非人动物细胞。8.根据权利要求5所述的靶向性表达载体，其中所述靶标存在于原核细胞上或原核细胞中，任选地，其中所述细胞是细菌细胞。9.根据任一项前述权利要求所述的靶向性表达载体，其中所述线性双链体DNA包括基因序列或其片段和任选的启动子。10.根据权利要求9所述的靶向性表达载体，其中所述基因或其片段编码功能性RNA分子。11.根据任一项前述权利要求所述的靶向性表达载体，其中所述载体包括修饰的核苷酸，任选地，在加帽末端中的修饰的核苷酸。12.根据任一项前述权利要求所述的靶向性表达载体，其中所述表达载体是基本上纯
的DNA，任选地，95％DNA。13.根据任一项前述权利要求所述的靶向性表达载体，其中所述结构基序允许在所述结构基序的序列中的核苷酸碱基之间形成氢键，任选地，其中所述核苷酸碱基之间的氢键涉及Watson
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Crick碱基对、Hoogsteen碱基配...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗，
申请(专利权)人：塔驰莱特IP有限公司，
类型：发明
国别省市：