重组质粒及其制备方法与应用技术

本申请提供了一种重组质粒及其制备方法及应用，本申请的重组质粒通过基因合成及染色体拷贝数定量，利用野生型gDNA和人工合成DNA模拟现实场景下的难以获得的病人或携带者阳性基因组DNA。采用本申请的重组质粒可以有效替代病人来源或者基因编辑细胞系的培养，可以实现方便快捷获得所需基因拷贝数变异阳性标准品。准品。准品。

【技术实现步骤摘要】
重组质粒及其制备方法与应用


[0001]本申请属于分子生物学领域，具体涉及一种重组质粒及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]基因大片段缺失和重复又称为基因拷贝数变异(Copy number variation，CNV)。随着CNV微阵列芯片技术以及二代测序技术的发展及应用，已发现拷贝数变异(CNV)广泛地存在于人类染色体基因组中。CNV主要由基因组重组导致，一般指长度为几kb到几Mb的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的重复，缺失和插入。目前CNV的检测方法主要有：多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术、微阵列比较基因杂交(array
‑
CGH)、单核苷酸多态性(SNP)分型芯片、高通量测序技术、荧光原位杂交(FISH)技术和实时荧光定量PCR技术(RT
‑
qPCR)等。但是无论上述哪种技术路线，在前期技术研发阶段或后期制备企业阳性参考品时，均需大量大片段缺失或重复阳性的基因组DNA。
[0003]传统的大片段缺失或重复阳性基因组DNA的制备主要有两种，其一为病人样本来源的细胞系培养，从而得到相应大片段缺失阳性的基因组DNA；其二为通过基因编辑的手段，如CRISPR
‑
Cas9系统人工编辑产生所需大片段缺失阳性的细胞系，核酸提取后得到大片段缺失阳性的基因组DNA。
[0004]而传统的方法不仅方法复杂，需要获取病人来源的细胞系或者采用基因编辑手段获取相应的细胞系，而且还需长时间细胞培养，存在效率低，成本高的问题。

技术实现思路

[0005]基于此，本申请提供一种重组质粒及其制备方法以解决传统技术中阳性标准品获取方法复杂，效率低的技术问题。
[0006]本申请的技术方案是，提供一种重组质粒及其制备方法与应用。
[0007]本申请一方面提供一种重组质粒，所述重组质粒包括目标片段，所述目标片段包括跨变异位点连接的第一片段和第二片段。
[0008]所述第一片段具有位于目标基因变异起点上游的长度为20bp～10000bp的序列；所述第二片段具有位于目标基因变异终点下游的长度为20bp～10000bp的序列。
[0009]在其中一个实施例中，所述第一片段具有位于目标基因变异起点上游的长度为20bp～2000bp的序列；所述第二片段具有位于目标基因变异终点下游的长度为20bp～2000bp的序列。
[0010]在其中一个实施例中，所述目标基因变异的位点选自为SEA基因的NC_000016.10:g.165401_184701del位点或SLC25A13基因的IVS16ins3kb位点。
[0011]在其中一个实施例中，所述第一片段具有位于SEA基因NC_000016.10:g.165401_184701del位点变异起点上游的长度为400bp～600bp的序列，所述第二片段具有位于SEA基因NC_000016.10:g.165401_184701del位点变异终点下游的长度为400bp～600bp的序列。
[0012]在其中一个实施例中，所述第一片段具有位于SLC25A13基因IVS16ins3kb位点变
异起点上游的长度为0.9kb～1kb的序列，所述第二片段具有位于SLC25A13基因IVS16ins3kb位点变异终点下游的长度为0.9kb～1kb的序列。
[0013]在其中一个实施例中，所述重组质粒的质粒载体选自pUC57、pUC57
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KAN、pUC
‑
SP、pBluescriptIISK+、pBluescriptIISK
‑
中的至少一种。
[0014]本申请另一方面提供一种重组质粒的制备方法，包括选定跨变异位点连接的目标片段，将目标片段导入质粒，再对质粒进行验证，获取重组质粒。
[0015]本申请还提供一种基因拷贝数变异阳性标准品，所述基因拷贝数变异阳性标准品包括上述的重组质粒与野生型基因组DNA。
[0016]本申请还提供一种的检测基因拷贝数变异的试剂盒，所述试剂盒包含上述的重组质粒。
[0017]在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液和PCR反应液中的一种或多种。
[0018]在其中一个实施例中，所述PCR反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg
2+
中的一种或多种。
[0019]本申请提供了一种重组质粒及其制备方法及应用，本申请的重组质粒通过基因合成及染色体拷贝数定量，利用野生型gDNA和人工合成DNA模拟现实场景下的难以获得的病人或携带者阳性基因组DNA。采用本申请的重组质粒可以有效替代病人来源或者基因编辑细胞系的培养，可以实现方便快捷获得所需基因拷贝数变异阳性标准品。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为地中海贫血α缺失
‑‑
SEA型待筛引物对PCR产物电泳图；
[0022]图2为希特林蛋白缺陷病受检者检测结果电泳图。
具体实施方式
[0023]下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
[0024]除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的
的技术人员通常理解的含义相同。
[0025]术语
[0026]本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项
目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
[0027]本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
[0028]本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
[0029]本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
[0030]本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括目标片段，所述目标片段包括跨变异位点连接的第一片段和第二片段；所述第一片段具有位于目标基因变异起点上游的长度为20bp～10000bp的序列；所述第二片段具有位于目标基因变异终点下游的长度为20bp～10000bp的序列。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述第一片段具有位于目标基因变异起点上游的长度为20bp～2000bp的序列；所述第二片段具有位于目标基因变异终点下游的长度为20bp～2000bp的序列。3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述目标基因变异的位点选自SEA基因的NC_000016.10:g.165401_184701del位点或SLC25A13基因的IVS16ins3kb位点。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述第一片段具有位于SEA基因NC_000016.10:g.165401_184701del位点变异起点上游的长度为400bp～600bp的序列，所述第二片段具有位于SEA基因NC_000016.10:g.165401_184701del位点变异终点下游的长度为400bp～600bp的序列。5.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述第一片段具有位于SLC25A13基因I...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯兵，李汉东，
申请(专利权)人：珠海市大道测序生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：