一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该双荧光素酶报告基因载体记为pGL3

【技术实现步骤摘要】
一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于分子克隆和基因编辑
，具体涉及一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤作为全球公共卫生问题，严重威胁人类健康。肿瘤代谢是肿瘤发生和发展过程中经历的必由之路。肿瘤细胞通过各种代谢途径自主改变其通量，以满足增加的生物能量和生物合成需求，并减轻肿瘤细胞增殖和存活所需的氧化应激。过去几十年，随着技术发展和应用，研究人员不仅揭示了肿瘤异质性和可塑性，同时还发现了维持肿瘤生长的新代谢途径。肿瘤代谢起源于Otto Warburg研究(Otto Warburg因发现线粒体呼吸链复合体IV而获得1931年诺贝尔生理学或医学奖)，他发现与正常组织相比，体外癌组织切片即使在有氧情况下也可利用大量葡萄糖产生乳酸，这种现象称为有氧糖酵解或Warburg效应。20世纪90年代，人们发现参与糖酵解的乳酸脱氢酶(LDHA)是癌基因MYC转录靶点，是肿瘤细胞糖酵解增加和致瘤所必需的，这为Warburg效应提供了分子基础，也是肿瘤治疗中，针对肿瘤代谢重编程的新兴治疗靶点。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是烟酰胺腺嘌呤二核苷(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)依赖性激酶，常见的A、B两种亚基可构成5种LDH同工酶(LDH1～5)，C亚基仅仅组成一种LDH同工酶LDH
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C4，又称为LDH
>‑
X。LDHA蛋白由LDHA基因编辑，LDHA基因位于甲基化热点11染色体的短臂。LDHA对丙酮酸有较高的亲和力，其主要作用是将丙酮酸转化为乳酸，将NADH转化为NAD+。在诸多癌症中，LDHA具有较高的表达谱和激活状态，LDHA通过多种机制与肿瘤的恶性生物学特性密切相关。LDHA可促进癌细胞增殖，维持细胞存活；LDHA有助于增强癌细胞的侵袭和转移；LDHA还可以触发血管生成以及协助癌细胞免疫逃逸。
[0003]肿瘤代谢研究开始于上世纪中期，然而在过去几十年中，靶向肿瘤代谢治疗的进展依然十分缓慢。只有少数基于代谢的抗肿瘤药物正在或准备进行临床试验，近年来针对肿瘤代谢方向的精准医疗方案的不断进展，科研工作者也逐渐认识到肿瘤药物设计框架必须考虑肿瘤免疫微环境(TIME)中非癌细胞的代谢脆弱性，以及癌细胞的代谢脆弱性。乳酸脱氢酶以LDHA和LDHB同源四聚体和异源四聚体形式存在，对Warburg效应至关重要。抑制LDHA和LDHB可能都具有治疗作用，不过大多数尝试都针对LDHA，尽管已经开发了几种有效的LDHA抑制剂，但小分子对其选择性抑制的成功率有限。因此，一款能够测量LDHA表达量的敏感识别元件亟待开发。专利CN113362956A“基于个体化代谢模型的肿瘤分型与潜在靶标预测方法”构建了肿瘤病人个体化代谢网络模型，该模型能够预测对肿瘤细胞生长具有重要影响的基因及药物潜在靶标，但该专利属于数据量化生物学模型，对肿瘤标记物LDHA表达量的预测分析特异性不佳。专利CN107119112A“一种检测肿瘤代谢通路基因表达的引物组、芯片及其应用”公开发表了168个肿瘤代谢相关基因的引物对，但该专利技术仅可测量肿瘤样本中LDHAmRNA水平的表达，对其LDHA由DNA甲基化所导致的表达水平变化以及其转录因
子结合位点，则无法进行考察。专利CN113056559A“用于乳酸脱氢酶(LDHA)基因编辑的组合物和方法”提供了一种用于在LDHA基因内进行编辑，例如引入双链断裂的组合物和方法，但该方法仅用于治疗患有高草酸尿症的受试者，无法应用于肿瘤患者治疗。

技术实现思路

[0004]基于解决以上上述问题，本专利技术的目的在于提供一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法和应用。
[0005]本专利技术的具体技术方案如下：
[0006]本专利技术第一方面提供一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，所述基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体记为pGL3
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LDHA
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promoter，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术第二方面提供所述基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，包括如下步骤：
[0008](1)以人卵巢上皮细胞A2780全基因组DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对，进行PCR扩增，得到LDHA基因启动子；
[0009](2)使用限制性内切酶Bgl II和Hind III对pGL3
‑
Basic质粒进行双酶切，得到pGL3
‑
Basic的线性化质粒；
[0010](3)将步骤(1)得到的LDHA基因启动子和步骤(2)得到的pGL3
‑
Basic的线性化质粒进行重组反应；
[0011](4)将步骤(3)所得重组产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证、酶切验证和测序鉴定，得到基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体。
[0012]进一步地，步骤(1)中所述PCR扩增的体系为：
[0013][0014][0015]步骤(1)中所述PCR扩增的程序为：
[0016][0017]进一步地，步骤(3)中所述重组反应的体系为：
[0018][0019]插入片段LDHA promoter与线性化载体的摩尔比＝1:2～1:5。
[0020]本专利技术第三方面提供人LDHA基因启动子的双荧光素酶识别系统，其包括所述基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体、pGL3
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Basic质粒和内参pRL
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TK质粒。
[0021]本专利技术第四方面提供所述基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体在检测细胞中人LDHA基因启动子活性中的应用。
[0022]本专利技术第五方面提供一种检测细胞中人LDHA基因启动子活性的方法，所述方法为：将pGL3
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LDHA
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promoter、pGL3
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Basic分别与内参pRL
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TK质粒共转入细胞中，检测相对荧光素酶活性的值，相对荧光素酶活性的值＝[荧光(pGL3
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LDHA
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promoter)
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荧光(pGL3
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Basic)]/荧光(pRL
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TK)，基于相对荧光素酶活性的值判定人LDHA基因启动子活性，所述相对荧光素酶活性的值越大，人LDHA基因启动子活性越强。
[0023]进一步地，所述pGL3
‑
LDHA
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promoter或pGL3
‑
Basic质粒的质量为1μg，所述内参pRL<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体，其特征在于，所述基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体记为pGL3
‑
LDHA
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promoter，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以人卵巢上皮细胞A2780全基因组DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对，进行PCR扩增，得到LDHA基因启动子；(2)使用限制性内切酶Bgl II和Hind III对pGL3
‑
Basic质粒进行双酶切，得到pGL3
‑
Basic的线性化质粒；(3)将步骤(1)得到的LDHA基因启动子和步骤(2)得到的pGL3
‑
Basic的线性化质粒进行重组反应；(4)将步骤(3)所得重组产物转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证、酶切验证和测序鉴定，得到基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增的体系为：步骤(1)中所述PCR扩增的程序为：4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述重组反应的体系为：步骤(3)中所述重组反应的体系为：插入片段LDHApromoter与线性化载体的摩尔比＝1:2～1:5。5.人LDHA基因启动子的双荧光素酶识别系统，其特征在于，其包括权利要求1所述基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体、pGL3
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Basic质粒和内参pRL
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TK质粒。6.权利要求1所述基于人LDHA基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体在检测细胞中
人LDHA基因启动子活性中的应用。7.一种检测细胞中人LDHA基因启动子活性的方法，其特征在于，所述方法为：将pGL3
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LDHA
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promoter、pGL3
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄晶，维杰，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：