新型高效的先导编辑器及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种基因先导编辑系统，包含载体，所述载体含有编码pegRNA的基因以及编码融合蛋白的基因，所述pegRNA包含sgRNA、逆转录模板RTT、主要结合位点PBS和RNA茎环结构；所述融合蛋白为Cas9切口酶或其变体与逆转录酶的融合蛋白。本发明专利技术采用通过在pegRNA的3'末端加入RNA颈环结构开发了sPEs,通过让pegRNA的3'末端结合到Cas9，开发了tPEs，以此来提高Cas9/pegRNA复合物的稳定性，进一步的提高在不同细胞中不同基因组位点的编辑效率。的编辑效率。的编辑效率。

【技术实现步骤摘要】
新型高效的先导编辑器及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及新型高效的先导编辑器及其应用，开发的新型高效的先导编辑器(prime editors):sPEs and tPEs技术属于基因治疗的平台技术，可以用于定点突变，插入，筛除基因组DNA片段等疾病的基因治疗。

技术介绍

[0002]人类的疾病大多与基因密切相关，所以根据基因进行针对性的改变一直是生命科学的长期愿望。尽管基因编辑技术取得了快速进展，但与疾病相关的75000多个人类已知的遗传变异中，大多数疾病还是存在难以纠正的问题。
[0003]利用工程性核酸酶例如ZFPs,TALENs或者CRISPR
‑
Cas可以有效的利用DNA 双链断裂(double strand breaks,DSBs)介导的DNA编辑方式，在特定基因组位点进行插入与缺失。但是，DSB的产生会导致许多不良的结果，比如编辑不单一，基因序列易位和P53的激活。
[0004]在细胞体内，染色质经常发生DNA双链断裂(DNA double
‑
strand breaks, DSBs)一方面是在减数分裂重组和脊椎动物免疫系统发育过程中所必需的，另一方面，DSB的错误修复会产生突变并促进基因组不稳定，无法修复DSBs会导致细胞死亡。通常来说，有两种主要的修复机制会被DSB所激活，一种是同源性介导修复(homology
‑
directed repair，HDR),另一种是非同源末端连接(non
‑ꢀ
homologous end joining，NHEJ)。作为DNA双链断裂最主要的修复通路，HDR 使用同源序列作为修复的模板以完成基因序列的校正，并且只能发生在细胞 G2/S期；相反，NHEJ在修复过程不需要同源序列就能在DSB附近的基因组位点引入插入和缺失。但是，由于同源重组机制本身的局限性，HDR介导的基因校正效率一直都很低(通常小于5％)。因此，极大的限制了CRISPR/Cas基因编辑工具从科研向应用的转变。应运而生的碱基编辑器(base editor,BE)，胞嘧啶和腺苷碱基编辑器可将C
·
G转化为T
·
A，将A
·
T转化为G
·
C，该方法虽然能极大的提高基因位点的编辑效率，但是该方法突变的方式单一并且需要 DNA双链断裂，对于精准治疗方面的应用，这些方法都具有一定的局限性。
[0005]先导编辑(prime editing)是在2019年底由MIT David Liu实验室专利技术的。这项技术被认为是基于CRISPR的第三代基因编辑技术，可以对基因组中的任何位点进行精确地点突变、小片段DNA的插入和缺失。目前先导编辑的主要问题是编辑效率在不同的细胞，不同的位点差异很大。所以优化先导编辑的效率迫在眉睫。

技术实现思路

[0006]先导编辑(prime editing)可以在没有双链断裂的情况下定点突变，插入，筛除基因组DNA片段。先导编辑器(prime editors)中pegRNA的稳定性和错误折叠会影响先导编辑的效率。与受Cas9蛋白保护的sgRNA相比，pegRNA 的3
‘
延伸部分可能暴露在细胞中，更容易受到外切核酸酶的降解，我们通过在pegRNA的3'末端加入RNA颈环结构开发了sPEs,通过让pegRNA的3'末端结合到Cas9，开发了tPEs，以此来以此来提高Cas9/pegRNA复合物的稳定性，降低3
’
末端的降解能力。sPEs和tPEs极大的提高了先导编辑的效率。
[0007]本专利技术的目的之一是提供一种基因先导编辑系统，包含载体，所述载体含有编码pegRNA的基因以及编码融合蛋白的基因，所述pegRNA包含sgRNA、逆转录模板RTT、主要结合位点PBS和RNA茎环结构；所述融合蛋白为Cas9 切口酶或其变体与逆转录酶的融合蛋白。
[0008]其中，所述RNA茎环结构选自以下至少一项：
[0009]1)序列分别如SEQ ID NO.1～4所示的MS2、PP7、ComBS或Csy4BS；
[0010]2)在1)的5
′
端和/或3
′
端添加一个或几个核苷酸得到的RNA序列；
[0011]3)与1)或2)的RNA序列具有85％以上的同一性的RNA序列。
[0012]所述RNA茎环结构连接于所述主要结合位点PBS的3
’
端；
[0013]所述pegRNA为RNA分子，从5
’
端至3
’
端依次为sgRNA、逆转录模板 RTT、主要结合位点PBS和RNA茎环结构；
[0014]所述融合蛋白还含有RNA结合蛋白RBP；所述RBP为特异性结合RNA 茎环结构的蛋白；所述RBP为一个或多个；
[0015]所述融合蛋白还含有RNA结合蛋白RBP；所述融合蛋白由N端至C端依次包括RBP、Cas9或其变体、逆转录酶；
[0016]所述载体为一个或多个；
[0017]所述编码pegRNA的基因或编码融合蛋白的基因为一个或多个；
[0018]所述编码pegRNA的基因或编码融合蛋白的基因位于同一载体或不同载体上。
[0019]所述RBP选自tdMCP、tdPCP、COM、Csy4H29A中的任一种；
[0020]所述Cas9切口酶为H840A；
[0021]所述逆转录酶为MMLV；
[0022]所述系统还含有筛选标记蛋白。
[0023]本专利技术另一目的是提供一种pegRNA，所述pegRNA为如上任一项所述的系统中所述的pegRNA。
[0024]本专利技术另一目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为如上任一项所述的系统中所述的融合蛋白。
[0025]本专利技术另一目的是提供一种核酸，所述核酸编码如上所述的pegRNA和/或融合蛋白。
[0026]本专利技术另一目的是提供一种构建体，所述构建体含有如上所述的核酸。
[0027]本专利技术另一目的是一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的构建体或基因组中整合有外源的如上所述的核酸。
[0028]如上所述的系统、pegRNA、融合蛋白、核酸、构建体或宿主细胞在以下至少一项中的应用：
[0029]1)用于生物体或生物细胞基因组序列的编辑；优选地，用于碱基替换；
[0030]2)用于制备生物体或生物细胞基因组序列的编辑的产品；
[0031]3)用于提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率；
[0032]4)用于制备提高生物体或生物细胞基因组序列的编辑效率的产品。
[0033]其中，用于DNA编辑或RNA编辑；优选地，用于DNA编辑；进一步优选地，用于SRD5A3，DYRK1A，HDAC1，BCL11A，GFAP，RUNX1，JAK2， SRD5A1，DMD和EED位点的编辑；更进一步优选地，用于SR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因先导编辑系统，包含载体，所述载体含有编码pegRNA的基因以及编码融合蛋白的基因，其特征在于，所述pegRNA包含sgRNA、逆转录模板RTT、主要结合位点PBS和RNA茎环结构；所述融合蛋白为Cas9切口酶或其变体与逆转录酶的融合蛋白。2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述RNA茎环结构选自以下至少一项：1)序列分别如SEQ ID NO.1～4所示的MS2、PP7、ComBS或Csy4BS；2)在1)的5
′
端和/或3
′
端添加一个或几个核苷酸得到的RNA序列；3)与1)或2)的RNA序列具有85％以上的同一性的RNA序列。3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，选自以下至少一项：1)所述RNA茎环结构连接于所述主要结合位点PBS的3
’
端；2)所述pegRNA为RNA分子，从5
’
端至3
’
端依次为sgRNA、逆转录模板RTT、主要结合位点PBS和RNA茎环结构；3)所述融合蛋白还含有RNA结合蛋白RBP；所述RBP为特异性结合RNA茎环结构的蛋白；所述RBP为一个或多个；4)所述融合蛋白还含有RNA结合蛋白RBP；所述融合蛋白由N端至C端依次包括RBP、Cas9或其变体、逆转录酶；5)所述载体为一个或多个；6)所述编码pegRNA的基因或编码融合蛋白的基因为一个或多个；7)所述编码pegRNA的基因或编码融合蛋白的基因位于同一载体或不同载体上。4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，选自以下任一项：1)所述RBP选自tdMCP、tdPCP、COM、Csy4H29A中的任一种；2)所述Cas9切口酶为H840A；3)所述逆转录酶为MMLV；4)所述系统还含有筛选标记蛋白。5.一种pegRNA，其特征在于，所述pegRNA为权利要求1～4任一项所述的系统中所述的pegRNA。6.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为权利要求1～4任一项所述的系统中所述的融合蛋白。7.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求5所述的pegRNA和/或如权利要求6所述的融合蛋白。8.一种构建体，所述构建体含有如权利要求7所述的核酸。9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：马涵慧，冯颖，刘思远，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：