一种CRISPR-MCPN载体及其构建方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR
‑
MCPN载体及其构建方法、应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种CRISPR
‑
MCPN载体及其构建方法、应用。

技术介绍

[0002]基于CRISPR/Cas系统的基因编辑与调控工具已经在多重领域：生命科学、生物工程、生物医药和农业新物种培育领域带来了创造性的变革。CRISPR/Cas9技术在多重CRISPR编辑中发挥着重要作用，它可以通过有限数量的调控元件来协调不同的过程，进而提高载体在细胞中使用效率。
[0003]在内源性RNA处理系统调控过程中，多重CRISPR技术在细胞记录器、遗传电路、生物传感器、组合遗传扰动、大规模基因组工程和代谢途径的应用方面具有广泛的应用前景。然而，基于CRISPR/Cas系统开发的基因编辑与调控工具在多重基因编辑与调控方面仍然存在着挑战，尤其是在提高基因编辑与调控的效率、特异性以及降低脱靶率等方面。现有技术能够进行多基因同时敲除，或者多基因同时激活，或者多基因同时抑制。然而生物调控过程是一个复杂的过程，需要多种水平调控同时进行，所以实现能够在同一个细胞中达到多水平调控、提高基因调控的效率是目前有待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术公开了一种CRISPR
‑
MCPN载体及其构建方法、应用，CRISPR
‑
MCPN载体可以实现在同一个细胞中达到多水平调控、提高基因调控的效率。
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供的技术方案如下：
[0006]一种CRISPR
‑
MCPN载体，所述载体包括CRISPR
‑
Cas9基因调控组件、tRNA
‑
array序列、融合在sgRNA的茎环中RNA发夹序列、适配体
‑
RNA结合蛋白和基因调控结构域，所述载体序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
[0007]进一步的，所述CRISPR
‑
Cas9基因调控组件包括无切割能力的失活型Cas9蛋白，所述失活型Cas9蛋白为dCas9，所述dCas9为引导调控结构域的工具。
[0008]进一步的，所述dCas9来源于230载体。
[0009]进一步的，所述tRNA
‑
array序列为tRNA将前体单链引导RNA串联起来的序列，所述前体单链引导RNA为sgRNA，所述tRNAarray序列中sgRNA序列包含RNA发夹序列，可以分别与配适体
‑
RNA结合蛋白特异性结合。
[0010]进一步的，所述适配体
‑
RNA结合蛋白为MCP、Com、PCP和λN22。
[0011]进一步的，所述基因调控结构域为HSF1
‑
VP64，KRAB，Dnmt3a，TET1。
[0012]上述载体的构建方法为：
[0013](1)将λN22与TET1连接，获得的片段为NTT；将Com、KRAB、PCP和DnmT3a连接，获得的片段为CKB
‑
PDT；将MCP和HSF1
‑
VP64连接获得片段MPH；将4或16条tRNAarray片段连接，获得片段4
×
tRNAarray或16
×
tRNAarray片段；
[0014](2)对步骤(1)中所述的NTT和CKB
‑
PDT进行BmtI
‑
AgeI双酶切，将酶切后的NTT作为载体骨架与酶切后的CKB
‑
PDT连接，获得中间载体CKB
‑
PDT
‑
NTT；
[0015](3)将步骤(2)中获得的中间载体CKB
‑
PDT
‑
NTT与步骤(1)中所述的MPH分别进行BmtI
‑
BIP1双酶切，将酶切后的CKB
‑
PDT
‑
NTT作为载体骨架与酶切后MPH的进行连接，获得中间载体MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT；
[0016](4)将步骤(3)获得的中间载体MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT与步骤(1)中所述的4
×
tRNAarray或16
×
tRNAarray分别进行BamHI
‑
PspXI双酶切，将酶切后的4
×
tRNAarray或16
×
tRNAarray与酶切后的MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT进行连接，获得中间载体MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT
‑4×
tRNAarray或MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT
‑
16
×
tRNAarray。
[0017](5)将步骤(4)获得的中间载体MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT
‑4×
tRNAarray或MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT
‑
16
×
tRNAarray与230载体进行SpeI+BmtI双酶切，所述230载体为获得dCas9的载体，将酶切后的MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT
‑4×
tRNAarray或MPH
[0018]‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT
‑
16
×
tRNAarray作为载体骨架与dCas9片段进行连接，获得dCas9
‑
MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT
‑4×
tRNAarray载体或dCas9
‑
MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT
‑
16
×
tRNA array，即为CRISPR
‑
MCPN载体。
[0019]上述的载体在多水平多基因的基因调控中的应用。
[0020]本专利技术所述的CRISPR
‑
MCPN载体及其构建方法使一个单一启动子能够在一个单一的转录本中同时表达多个蛋白和gRNAs。从而实现一个单独载体可以使激活、抑制、甲基化和去甲基化四种功能在同一细胞中独立作用。
附图说明<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR
‑
MCPN载体，其特征在于，所述载体包括CRISPR
‑
Cas9基因调控组件、tRNA
‑
array序列、融合在sgRNA的茎环中RNA发夹序列、适配体
‑
RNA结合蛋白和基因调控结构域，所述载体序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述CRISPR
‑
Cas9基因调控组件包括无切割能力的失活型Cas9蛋白，所述失活型Cas9蛋白为dCas9，所述dCas9为引导调控结构域的工具。3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述dCas9来源于230载体。4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述tRNA
‑
array序列为tRNA将前体单链引导RNA串联起来的序列，所述前体单链引导RNA为sgRNA，所述tRNAarray序列中sgRNA序列包含RNA发夹序列。5.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述适配体
‑
RNA结合蛋白为MCP、Com、PCP和λN22。6.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述基因调控结构域为HSF1
‑
VP64，KRAB，Dnmt3a，TET1。7.权利要求1至6任意一项所述的载体的构建方法，其特征在于，所述方法为：(1)将λN22与TET1连接，获得的片段为NTT；将Com、KRAB、PCP和DnmT3a连接，获得的片段为CKB
‑
PDT；将MCP和HSF1
‑
VP64连接获得片段MPH；将4或16条tRNAarray片段连接，获得片段4
×
tRNAarray或16
×
tRNAarray片段；(2)对步骤(1)中所述的NTT和CKB
‑
PDT进行BmtI
‑
AgeI双酶切，将酶切后的NTT作为载体骨架与酶切后的CKB
‑
PDT连接，获得中间载体CKB
‑
PDT
‑
NTT；(3)将步骤(2)中获得的中间载体CKB
‑
PDT
‑
NTT与步骤(1)中所述的MPH分别进行BmtI
‑
BIP1双酶切，将酶切后的CKB
‑
PDT
‑
NTT作为载体骨架与酶切后MPH的进行连接，获得中间载体MPH
‑
CKB
‑
PDT
‑
NTT；(4)将步骤(3)获得的中间载...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟彦双，徐倩倩，刘忠华，姜超前，耿立爽，王金鹏，李鑫禹，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：