用于检测乳糖不耐受的工具和方法及其用途技术

本发明专利技术涉及通过横向流动免疫测定法检测样品中乳糖耐受性标记物的方法、横向流动免疫检测装置、引物和提取缓冲液及其用途以及在所述方法中有用的相关工具和测定。述方法中有用的相关工具和测定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测乳糖不耐受的工具和方法及其用途


[0001]本专利技术涉及通过LFA检测生物样品中乳糖不耐受标记物的方法。本专利技术涉及在所述方法中有用的相关工具和测定。

技术介绍

[0002]成人型乳糖酶缺乏症也称为乳糖酶非持久性或乳糖不耐受症，是一种广泛的常染色体隐性遗传病，由肠细胞中乳糖酶根皮苷水解酶(LPH)活性的生理性下降引起(Enattah et al.,2002,Nature Genetics,30,233
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237；Misselwitz et al.,2019,Gut,68:2080
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2091)。
[0003]乳糖不耐受是指由于这种位于小肠的专用酶的活性不足而无法消化乳糖。因此，未消化的乳糖分子被存在于结肠菌群中的细菌处理，并产生副产物，导致腹痛、腹胀、胀气、腹泻和气体膨胀等临床症状。当诊断出不耐受时，含乳糖的食物被排除在饮食之外，这可能会增加营养缺陷的风险，例如，骨矿物质峰值骨量的改变和严重骨质疏松症的易感性(Mattar etal.,2012,Clinical and Experimental Gastroenterology,5 113
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121；Misselwitz et al.,2019,supra)。
[0004]据评估，这种情况影响了约68％(95％CI 64
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72)的世界人口，可能导致乳糖不耐受(LI)(Storhaug et al.,2017,Lancet Gastroenterol Hepatol,2:738
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46)。患病率变化很大，与地理区域相关，从西北欧(丹麦)的5％到一些亚洲和非洲人口的几乎100％(Di Stefano et al.,2009,Digestive and Liver Disease,41,474
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479；Harrington et al.,2008,Int J Clin Pract,October,62,10,1541
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1546；Storhaug et al.,2017,supra)。预计全球乳糖不耐受治疗市场(包括食品补充剂、食品、酶和治疗/诊断)的复合年增长率将达到7.10％，到2025年将达到410亿美元。
[0005]目前的标准方法是在摄入50克乳糖后进行呼气氢测试，其中通过每隔一段时间测量呼气氢来监测肠道菌群对未消化乳糖的发酵(Enko et al.,2014,Gastroenterology Research and Practice,464382；Marton et al.,2012,Aliment Pharmacol Ther,35:429
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440)。尽管该测试被广泛使用，但它依赖于细菌菌群的活性，这些菌群可被抗生素或酸性结肠pH值改变，从而导致假阴性结果。此外，由于产生大量氢气、二氧化碳和甲烷，测试可能会对患者非常痛苦。与基因多态性C/T
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13910相比，诊断性能显示出良好的相关性，总体敏感性为88％，特异性为85％(Marton et al.,2012,supra)。
[0006]测量粪便中的总糖和还原糖以及粪便pH值是儿童乳糖吸收不良的间接测试。乳糖不耐受婴儿的粪便pH值通常低于5.5至6.0。高达0.25％的总糖/还原糖被认为是正常的。在患有生理性乳糖吸收不良的母乳喂养婴儿中，浓度可能更高。由于假阴性率高，不建议对2岁以上的儿童进行该测试(Heine et al.,2017,World Allergy Organization Journal,10:41)。
[0007]其他成熟的检测方法，虽然侵入性很强，但依赖于对患者小肠活检样本进行乳糖酶活性的直接测量。与C/T
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13910多态性相比，截止值为10U/g蛋白质的快速乳糖酶试验
(Biohit)可以有效地识别严重十二指肠低乳症患者，敏感性和特异性分别为95％和100％(Kuokkanen et al.,2006,Endoscopy,38(7):708
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712)。
[0008]在基因上，乳糖酶编码基因(LCT)的表达受到位于MCM6基因中的调控区的影响，该调控区位于LCT上游约14kb。核苷酸中的几个变体，特别是单核苷酸多态性(SNP)，已经与乳糖酶持久性和非持久性相关。SNP是DNA序列变异的最简单形式(只有一个修饰的核苷酸)。
[0009]在欧洲，主要的变体被确定为
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13901C＞T。其他变体如
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13907C＞G和
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13915T＞G在来自非洲和中东的移民中发现(Abildgaard et al.,2018,Clinica Chimica Acta,482,50
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56)。在实践中，在该位点(
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13910C＞T)携带一个或两个T等位基因拷贝(C/T或T/T)的个体具有足够的乳糖酶活性。相反，没有T等位基因(C/C)拷贝的个体无法消化乳糖，被归类为乳糖不耐受者(Carlos et al.,2017,Biotechnology Reports,16,21
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25；Enattah et al.,2002,同上，如图1所示)。几个小组通过呼吸试验研究了基因测试和乳糖酶活性之间的相关性，发现这两种方法之间有很好的一致性(Di Stefano et al.,2009,supra；Marton et al.,2011,supra)。阳性基因测试表明患者是否有乳糖酶不持久的遗传倾向，但不能提供患者实际症状的信息(Di Stefano et al.,2009,supra)。
[0010]目前，为了进行DNA的高保真PCR扩增，基因测试在设备齐全的实验室进行，没有污染物。等温扩增技术是一种新的DNA扩增方法。环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等人于2000年开发的一种方法(Notomi etal.,2000,Nucleic Acids Res.,28(12):E63)，用于在50
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70℃下扩增DNA。该方法使用DNA聚合酶和一组四个特别设计的引物，识别目标DNA上总共六个不同的序列。含有目标DNA的有义和反义链序列的内部引物启动LAMP。由外引物引发的以下链置换DNA合成释放单链DNA。这是DNA合成的模板，由与靶的另一端杂交的第二个内部和外部引物启动，从而产生干环DNA结构。在随后的LAMP循环中，一个内部引物与产品上的环杂交，并启动置换DNA合成，产生原始的茎环DNA和具有两倍长度的茎的新茎环DNA。循环反应继续进行，在不到一小时内累积109个拷贝的目标。最终产物是具有多个反向重复的靶的茎环DNA和具有多个环的菜花状结构，这些环是通过在同一条链中靶的交替反向重复之间退火形成的。LAMP方法已广泛用于细菌、寄生虫和病毒感染；抗生素耐药性与细菌毒素(Schoepp et al.,2017,Sci.Transl.Med.9,e本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于定性或定量检测生物样品中T等位基因(
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13910C/T)或A等位基因(
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22018G/A)的存在的横向流动免疫测定装置，包括背衬支撑件和在所述背衬支撑上的毛细流动阵列和芯吸垫，其中所述毛细管流动阵列包括：i)样品接收垫，位于所述背衬支撑件的一端并且具有孔以接收样品；ii)缀合物释放垫，与所述样品接收垫不同或包括在所述样品接收垫中，并且与所述样品接收垫毛细管接触，并且浸渍有至少一种检测试剂，所述检测试剂包含第一粘合剂，特异性的并与至少一种标记的等位基因结合，所述等位基因选自与第一标记部分缀合的T等位基因(
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13910C/T)或A等位基因(
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22018G/A)分析物；iii)检测垫，所述检测垫与所述缀合物释放垫不同并且与所述缀合物释放垫毛细接触并且包括检测膜、包括至少一条试剂测试线的捕获测试试剂阵列和包括一条对照试剂线的捕获对照试剂阵列，所述捕获试剂和对照试剂阵列固定在所述检测膜上；以及iv)在所述背衬支撑件的另一端的芯吸膜，并且与所述检测垫毛细接触，其中所述至少一种试剂测试线包含至少一种针对所述标记的等位基因的标记的抗体，并且所述对照试剂线包含对所述第一粘合剂具有特定亲和力的对照试剂。2.根据权利要求1所述的横向流动免疫测定装置，其中所述缀合物释放垫包括检测试剂载体，其中当选自T等位基因(
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13910C/T)或A等位基因(
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22018G/A)分析物的标记的等位基因存在于样品中并与所述检测试剂结合，所述至少一种检测试剂以毛细管可释放的方式结合，从所述样品接收垫接收样品，并从其检测试剂载体释放检测试剂，并且形成第一免疫复合物，所述第一免疫复合物然后迁移到所述检测垫，在那里它与包含针对所述标记的等位基因的标记的抗体的至少一种试剂测试线结合。3.根据权利要求1或2所述的横向流动装置，其中所述检测垫还包括所述捕获测试试剂阵列中的多于一个的试剂测试线。4.根据权利要求1至3中任一项所述的横向流动装置，其中所述捕获测试试剂阵列包含选自抗DIG抗体、抗FAM和/或抗FITC抗体或其组合的至少一种抗体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的横向流动免疫测定法，其中所述检测试剂包含链霉亲和素蛋白作为所述分析物的第一粘合剂。6.一种用于检测样品中T等位基因(
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13910C/T)和/或A等位基因(
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22018G/A)的存在的方法，所述方法包括：a)提供包含水溶液中的DNA材料(扩增子)的样品，其中在所述DNA材料中，靶向来自T等位基因(
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13910C/T)和/或A等位基因(
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22018G/A)的DNA进行特异性扩增和标记；b)使所述样品经受横向流免疫测定，所述横向流免疫测定包括：i)包含所述标记的扩增等位基因的检测试剂的缀合物释放垫；和ii)包含检测膜的检测垫，其中结合至少一种针对所述扩增的等位基因的标记的抗体；c)在所述至少一种针对所述扩增的等位基因标记的抗体结合的位置处检测所述检测膜上是否存在检测线，所述检测线的存在指示所述样品中的T等位基因(
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13910C/T)和/或A等位基因(
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22018G/A)的存在。7.根据权利要求6所述的方法，其中将至少一种抗DG抗体或其混合物进一步结合到所述横向流动免疫测定的检测膜上，并且在步骤C)中检测DG标记的T等位基因(
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13910C/T)的存在。8.根据权利要求6或7所述的方法，其中至少一种抗FAM或抗FITC抗体或它们的组合结
合到所述横向流动免疫测定的检测膜上，并且在步骤c)下检测FAM和/或FITC A等位基因(
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22018G/A)的存在。9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中T等位基因(
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13910C/T)和/或A等位基因(
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22018G/A)的缺失表示乳糖不耐受。10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中步骤a)中提供的DNA材料是通过在提取步骤中LAMP扩增之前对从生物样品中提取的DNA进行LAMP扩增而获得的，其中所述生物样品在包含约0.1至约0.5mM EDTA和约20至约50mM NaOH的提取缓冲液的存在下进行DNA提取步骤。11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述扩增的DNA材料(扩增子)是从LAMP扩增获得的，其中来自T等位基因(
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13910C/T)的DNA是使用选自以下组的一组引物特异性扩增和标记的：
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：F，
类型：发明
国别省市：