一种核酸序列扩增和标记的方法技术

本发明专利技术公开了一种核酸序列扩增和标记方法，其中，核酸序列扩增标记方法包括以下步骤：将模板核酸序列、核苷酸单体混合物、和/或引物、核酸聚合酶和包含多个核酸条形码分子的载体共同分配至分区，利用具有链置换活性的核酸聚合酶和连接在载体上的核酸条形码分子序列对模板核酸序列进行扩增与标记，从而为测序文库的构建提供原材料。对于来自单个或多个细胞的基因组DNA，本发明专利技术的方法可以实现单细胞的全基因组扩增与条形码化标记，减少实验操作步骤，适于大规模的核酸测序，提高测序效率以及基因组的测序覆盖率，而一锅法扩增加标记的反应过程大大降低反应物交叉污染的风险，提高了测序的准确性。测序的准确性。测序的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸序列扩增和标记的方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种核酸序列扩增和标记的方法。

技术介绍

[0002]基因组测序可以用来获得各种各样的生物医学背景的信息，包括诊断学、预后、生物技术和法医生物学。对于单细胞测序技术而言，其主要过程包括：单细胞的分离、单细胞的裂解、核酸序列的扩增、单个细胞核酸序列的条形码化、高通量测序、数据处理与分析。近年来，针对单细胞的研究通常利用微流控技术完成，其中包括单细胞的分离、单细胞的裂解、核酸序列的扩增以及单个细胞核酸序列的条形码化。多个步骤的微流控操作增加了实验流程的复杂度和细胞间核酸序列丢失或交叉污染的风险。
[0003]因此，对于提高测序效率以及基因组的测序覆盖率，需要有高质量的核酸扩增技术以及在扩增的同时实现核酸序列的条形码化标记，以减少实验操作步骤和降低反应物交叉污染的风险。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种用于扩增和标记核酸序列的方法，以及使用这些方法制备的文库。本专利技术提供的扩增和标记核酸序列的方法能够实现在扩增的同时完成核酸序列的条形码化标记，减少实验操作步骤，适于大规模的核酸测序，提高测序效率以及基因组的测序覆盖率，减少了测试时间；同时，一锅法的反应过程大大降低反应物交叉污染的风险，提高了测序的准确性。
[0005]本公专利技术提供了一种对核酸序列进行扩增和标记的方法。所述方法包括：
[0006]步骤1：将核酸序列、扩增反应混合物与载体共同分配至分区；
[0007]其中，扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物、核酸聚合酶、和/或引物；载体包含与之连接的多个核酸条形码分子；
[0008]步骤2：将核酸条形码分子从载体上释放至分区内；
[0009]步骤3：在温控程序下对核酸序列进行扩增，并将核酸条形码分子附接至分区内核酸序列的扩增子序列上以进行核酸标记。
[0010]在一些实施方案中，扩增反应混合物包含：核苷酸单体混合物、核酸聚合酶和第一引物，第一引物包括通用序列和可变序列，核酸聚合酶可用于PCR反应且具有链置换活性；
[0011]核酸条形码分子的3'端包含通用序列作为扩增标记核酸序列的第二引物；
[0012]温控程序包括两段，在第一温度循环程序下，使得第一引物的可变序列与核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增产物1，其中核酸扩增产物的5'端包含通用序列，3'端包含通用序列的互补序列；在第二温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的第二引物退火至核酸扩增产物的3'端并通过聚合酶进行延伸，得到扩大的核酸扩增产物2，其中扩大的核酸扩增产物2被所述核酸条形码分子的条形码序列所标记。
[0013]在一些实施方案中，扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物和核酸聚合酶，核酸
聚合酶具有链置换活性；核酸条形码分子的3'端包含可变序列作为扩增标记核酸序列的引物；
[0014]温控程序选自温度循环程序和恒温扩增程序；
[0015]其中，在温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，其中核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列，3'端包括核酸条形码分子序列的互补序列；
[0016]在恒温扩增程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，所述核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列。
[0017]在一些实施方案中，所述核酸序列可以是单个细胞或多个细胞或非细胞材料的基因组DNA。
[0018]在一些实施方案中，所述核酸序列包含在细胞中，在进行核酸序列扩增前，其包括先将单个细胞或多个细胞和细胞裂解试剂共同分配至分区进行核酸序列的提取，优选地，所述分区可以是液滴。
[0019]在一些实施方案中，所述细胞为微生物细胞，所述裂解细胞的方法可为酶裂解法或碱裂解法或物理裂解法。
[0020]在一些实施方案中，在所述步骤1之前还包括将包含细胞与细胞裂解试剂的分区置于裂解循环程序，使得所述细胞裂解并释放出所述基因组DNA。
[0021]在一些实施方案中，所述酶裂解法的试剂可包括溶葡球菌酶(lysostaphin,Sigma)、溶酶菌(lysozyme,prepGEM Bacteria)、Green+buffer(prepGEM Bacteria)和prepGEM(prepGEM Bacteria)。
[0022]所述酶裂解程序为37℃，30min；75℃，10min，95℃5min；4℃，+∞。
[0023]在一些实施方案中，所述包含通用序列和可变序列的第一引物选自5'
‑
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNNNN
‑
3'(N8 primer)、5'
‑
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG
‑
3'(N5G3 primer)或5'
‑
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNTTT
‑
3'(N5T3 primer)，并且所述连接在核酸条形码分子3'端的第二引物具有5'
‑
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG
‑
3'的序列，其中N为任意的可与天然核酸进行碱基配对的核苷酸。
[0024]在一些实施方案中，所述核酸聚合酶具有链置换活性。
[0025]在一些实施方案中，所述核酸聚合酶选自Bst DNA聚合酶(全长)、Bst DNA聚合酶(大片段)、Bst DNA 2.0聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶、Bst(exo
‑
)DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Deep Vent(exo
‑
)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(exo
‑
)DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、KlenowFragment DNA聚合酶Ⅰ，及其任意组合。
[0026]在一些实施方案中，所述扩增反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：(NH4)
+
、SO
42
‑
、K
+
、Cl
‑
、Mg
2+
、Triton X
‑
100、和BSA。
[0027]在一些实施方案中，所述扩增反应混合物进一步包括pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5
‑
9.0之间。
[0028]在一些实施方案中，所述扩增反应混合物包括20mM Tris
‑
HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、3.5mM MgSO4、0.1％Triton X
‑
100、0.3mM dNTPs mix、0.17uMN5G3 primer、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸序列扩增和标记的方法，包括：步骤1：将核酸序列、扩增反应混合物与载体共同分配至分区；其中，扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物、核酸聚合酶、和/或引物；载体包含与之连接的多个核酸条形码分子；步骤2：将核酸条形码分子从载体上释放至分区内；步骤3：在温控程序下对核酸序列进行扩增，并将核酸条形码分子附接至分区内核酸序列的扩增子序列上以进行核酸条形码化标记。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩增反应混合物包含：核苷酸单体混合物、核酸聚合酶和第一引物，第一引物包括通用序列和可变序列，核酸聚合酶可用于PCR反应且具有链置换活性；所述核酸条形码分子的3'端包含所述通用序列作为扩增标记核酸序列的第二引物；所述温控程序包括两段，在第一温度循环程序下，使得第一引物的可变序列与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增产物1，其中核酸扩增产物的5'端包含所述通用序列，3'端包含所述通用序列的互补序列；在第二温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的第二引物退火至核酸扩增产物的3'端并通过聚合酶进行延伸，得到扩大的核酸扩增产物2，其中扩大的核酸扩增产物2被所述核酸条形码分子的条形码序列所标记。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物和核酸聚合酶，核酸聚合酶具有链置换活性；所述核酸条形码分子的3'端包含可变序列作为扩增标记核酸序列的引物；所述温控程序选自温度循环程序和恒温扩增程序；其中，在温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，其中核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列，3'端包括核酸条形码分子序列的互补序列；在所述恒温扩增程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，所述核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中所述分区内的核酸序列的扩增标记反应为一锅法反应，在所述分区内使反应物连续进行一步或多步反应。5.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中所述核酸序列作为扩增反应的底物，包括基因组脱氧核糖核酸，所述脱氧核糖核酸可选自以下一种或多种：质粒、经过降解得到的病毒的基因组、经过裂解得到的单细胞或多个细胞的全基因组、RNA逆转录得到的cDNA。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞选自真核生物细胞或微生物细胞。7.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中所述聚合酶选自BstDNA聚合酶(全长)、BstDNA聚合酶(大片段)、BstDNA2.0聚合酶、Bst3.0DNA聚合酶、Bst(exo
‑
)DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、DeepVent(exo
‑
)DNA聚合酶、DeepVentDNA聚合酶、Vent(exo
‑
)DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、KlenowFragmentDNA聚合酶Ⅰ中的一种或多种。8.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一引物和第二引物包含的通用序列是一段特定序列，其被选择使得基本上不会与模板核酸序列结合产生扩增。
9.根据权利要求2
‑
3任一项所述的方法，其中所述可变序列选自(N)
n
、(N)
n
GGG和(N)
n...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑文山，李璐瑶，
申请(专利权)人：墨卓生物科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：