一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法。该策略针对目标exRNA，设计了可与之高特异性结合的锁环探针，同时依赖连接反应增强识别，可实现目标序列的精准靶向；利用滚环扩增反应对低丰度exRNA进行扩增，实现信号的一次放大；进一步将DNAzyme与RCA产物耦合，利用Mg

【技术实现步骤摘要】
一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测领域，具体为一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法。

技术介绍

[0002]外泌体几乎存在于所有的体液中，是RNA、DNA、蛋白质和脂质转移的重要载体，具有独特的生物学特性。通过细胞间通讯，外泌体可与邻近细胞交流，从而调节细胞微环境、参与细胞分化和促进肿瘤细胞的增殖侵袭等。越来越多的证据表明，外泌体RNA中包含原始细胞和疾病进展有关的重要信息，异常的外泌体RNA表达与疾病的发生发展密切相关。长期以来，外泌体RNA被认为是有价值的疾病诊断和预后生物标志物，在各种病理过程中发挥着重要的调节作用，可用于肿瘤早期诊断、疾病监测和治疗反应评估等。因此，实现低表达和微小变化的exRNA的精准检测不仅有助于理解外泌体的生物学作用，而且能够为医学诊断提供新视角。
[0003]RNA印迹法是最早用于RNA检测的方法之一，但其只能进行半定量检测，灵敏度不高，且受限于使用的抗体和探针的选择。RNA测序技术检测通量高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计可特异性识别目标exRNA的锁环探针，设计可触发滚环扩增反应的引物及设计可特异性结合滚环扩增产物的DNAzyme结构序列；(2)加入T4多聚核苷酸激酶、ATP、T4多聚核苷酸激酶缓冲液将锁环探针进行5
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端磷酸化；(3)将靶标exRNA与磷酸化的锁环探针进行特异性识别和杂交，在T4 DNA连接酶的作用下，形成完整双链结构；(4)加入phi29 DNA聚合酶、dNTPs及引物，引发滚环扩增反应，实现信号的一次放大；(5)加入可与滚环扩增产物特异性结合的DNAzyme结构序列，触发DNAzyme结构自催化底物循环切割过程，释放荧光信号的同时实现信号的二次放大；(6)通过酶标仪荧光检测系统对靶标exRNA进行检测，从而实现外泌体RNA的定量分析。2.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应耦合DNAzyme双重等温扩增技术的exRNA检测方法，其特征在于，步骤(1)中，针对的靶标是miR
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21，序列(5
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)为TGAGG TAGTA GGTTG TATAG TT，设计的锁环探针序列(5
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)为CTGAT AAGCT AAACT ATACAACATACTACC TCACT CCTTG TTGAC CCTGG AGGGT AGGAG GTGCATTCAT ATTCG TCGTC AACAT CAGT，设计的引物序列(5
’‑3’
)为TGAGG TAGTATGTTG TATAG TT，设计的DNAzyme结构包含DNAzyme1、DNAzyme2及DNAzyme3，其中DNAzyme1序列(5
’‑3’
)为CTCCT TGTTG ACGTT ACACC CATGT TACTC TC，DNAzyme2序列(5
’‑3’
)为TGATATCAGC GATTAACCCT GGAGG GTAG，DNAzyme3序列(5
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)...

【专利技术属性】
技术研发人员：任晓君，马晓晨，夏玉晴，雷欣，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：