用于核酸的快速检测和绝对量化的基于数字CRISPR的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测和定量样品中的靶核酸的基于数字CRISPR的方法，所述方法包括：形成包含样品核酸、用于扩增一种或多种靶核酸序列的等温扩增反应试剂的混合物；将所述混合物分配至多个区室中；将所分配的混合物在用于等温扩增和Cas效应子切割所扩增的DNA链的温度下孵育；检测来自切割所述非靶序列的信号，从而检测所述样品中的一种或多种靶序列；以及基于阳性与阴性区室的比例的泊松分布确定所述靶核酸的拷贝数。本发明专利技术还涉及一种用于检测受试者中疾病的存在和/或的方法，以及一种定量样品中核酸的试剂盒。在某些实施方案中，所述靶核酸是SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸的快速检测和绝对量化的基于数字CRISPR的方法


[0001]本专利技术涉及用于检测和定量样品中的靶核酸的基于数字CRISPR的方法、用于此类方法的试剂盒以及用于检测受试者中疾病的存在和/或严重程度的方法。

技术介绍

[0002]通常将DNA和RNA用作检测靶标，以指示生物实体的存在。从生物医学研究到临床诊断再到环境保护等各个领域都需要核酸量化技术。广泛使用的RT
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qPCR作为COVID
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19诊断的金标准在速度和灵敏度方面具有优势，但是需要精确的热循环和高PCR效率。经由RT
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qPCR的量化依赖于外部标准或参考物质的使用，并且结果可以是可变的，即使在经过培训的实验室中仍报道了20％
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30％的可变性[Sedlak,R.H.和Jerome,K.R.Diagnostic microbiology and infectious disease 75:1
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4(2013)]。因此，具有改善的精密度和准确度的绝对量化方法对于病毒研究至关重要。
[0003]数字PCR被越来越多地用作核酸绝对量化的高度准确且灵敏的方法[Salipante,S.J.和Jerome,K.R.Clinical chemistry 66:117
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123(2020)；Sedlak,R.H.和Jerome,K.R.Diagnostic microbiology and infectious disease 75:1
‑<br/>4(2013)]。在数字PCR反应中，将PCR混合物分离为数千个单独的反应，导致每个分区中存在零个或一个核酸靶分子。在对每个分区进行独立的PCR扩增和终点荧光检测之后，基于阳性分区的比例确定样品的拷贝数。由于独立地进行每个分区中的PCR反应，因此通过数字PCR进行的绝对量化更精确、对抑制剂的耐受性更高、并且克服了扩增效率差[Whale,A.S.等人Nucleic acids research 40:e82
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e82(2012)]。基于数字PCR的病毒检测的灵敏度和精密度已经在例如SARS
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CoV
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2感染的患者样品的定量检测和病毒载量分析中得到证明，其中检测限(LOD)为约2拷贝/反应，并且与RT
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PCR相比，假阴性和假阳性较少[Alteri,C.等人PloS one 15:e0236311(2020)；Liu,X.等人Emerging microbes&amp;infections 9:1175
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1179(2020)；Suo,T.等人Emerging microbes&amp;infections 9(1):1259
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1268(2020)；Yu,F.等人Clinical Infectious Diseases 71:793
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798(2020)]。除了在病毒诊断中的应用外，数字PCR还成功地用于病毒研究的其他领域(包括SARS
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2的空气动力学传播的研究)以及用于通过鼻咽拭子
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qPCR测试量化病毒阴性患者的肺组织中残余SARS
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CoV
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2载量[Liu,Y.等人Nature 582:557
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560(2020)；Yao,X.
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H.等人Cell research 30:541
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543(2020)]。然而，数字PCR的主要缺点是，由于在热循环期间有效的分区间热传递的1
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2℃/s升降温速率，因此需要相对较长的反应时间(约4小时)，相比之下，qPCR则需要1小时。因此，减少数字PCR的反应时间对于能够在快速病毒检测中采用所述技术是至关重要的。
[0004]在病毒检测中也使用了等温扩增方法，其在恒定温度下扩增核酸靶分子，从而减少反应时间。这些方法包括采用重组酶聚合酶扩增(RPA)或环介导的等温扩增(LAMP)的方法[Notomi,T.等人Nucleic acids research 28:E63
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E63(2000)；Piepenburg,O.等人PLOS Biology 4:e204(2006)；Tomita,N.等人Nature protocols 3:877
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882(2008)]。最近，已经开发了使用RNA指导的CRISPR/Cas系统的创新诊断方法来检测核酸。在RNA指导的CRISPR/
Cas系统中，利用Cas效应子(如Cas12a、Cas12b和Cas13a)的“附带切割活性”：一旦Cas蛋白发现并切割其特定的DNA/RNA靶标，它就会结合并降解其他非特异性DNA/RNA寡核苷酸，如荧光标记的报告基因寡核苷酸[Chen,J.S.等人Science 360:436
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439(2018)；Gootenberg,J.S.等人Science 356:438
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442(2017)；Li,S.Y.等人Cell discovery 4:20(2018)]。通过将RPA或LAMP介导的靶分子的等温扩增与CRISPR/Cas生物传感系统相结合，诸如SHERLOCK和DETECTR的方法已经成功证明了临床样品中的登革病毒、人乳头瘤病毒以及SARS
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2的检测[Broughton,J.P.等人Nature biotechnology(2020)；Ding,X.等人Nature communications 11:4711(2020)；Gootenberg,J.S.等人Science 356:438
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442(2017)；Li,S.Y.等人Cell discovery 4:20(2018)]。然而，由于基于CRISPR的方法不是定量的并且需要在扩增与检测步骤之间进行多次操作，因此仍然需要定量、快速且稳健的病毒检测方法。
[0005]需要一种改进的分子平台以实现对核酸和其他靶分子的快速、可视化和模块化检测以及量化。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种核酸检测和量化系统，所述核酸检测和量化系统包括：CRISPR系统，其包含效应蛋白和一种或多种被设计为与相应靶分子结合的指导RNA；基于核酸的掩蔽构建体；样品分配步骤，其将所述样品细分至多个区室中；以及任选地，用于扩增样品中的靶分子的核酸扩增试剂。此方法将定量数字PCR、快速等温扩增和特异性CRISPR检测的优点组合在一锅式反应系统中，所述一锅式反应系统将单独的反应分配至高密度芯片中的多个小区室中。在这项研究中，我们展示了一种数字CRISPR方法(也称为快速数字Crispr方法，RADICA)，所述方法允许在一小时内在恒定温度下对核酸进行绝对量化。我们使用含有SARS
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CoV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测和定量样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：a)形成混合物，所述混合物包含：样品核酸；用于扩增一种或多种靶核酸序列的等温扩增反应试剂；Cas12a、Cas12b、Cas13b或Cas14效应子或其衍生物；含有DNA靶向序列并且被设计为与所述Cas效应子形成复合物的至少一种指导多核苷酸；以及含有非靶序列的基于核酸的掩蔽构建体，b)将所述混合物分配至多个区室中；c)将所分配的混合物在用于等温扩增以及Cas效应子切割所扩增的DNA链的温度下孵育，其中所述Cas效应子展现出附带核酸酶活性，并且一旦被所述靶序列激活则切割所述基于核酸的掩蔽构建体的非靶序列；以及d)检测来自切割所述非靶序列的信号，从而检测所述样品中的一种或多种靶序列，以及e)基于阳性与阴性区室的比例的泊松分布确定所述靶核酸的拷贝数。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas效应子是Cas12a或Cas12b。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法用于检测和/或量化样品中的病原体、基因表达、基因拷贝数变异或外来因子。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述至少一种指导多核苷酸是crRNA。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述扩增选自基于核酸序列的扩增、重组酶聚合酶扩增、环介导的等温扩增、链置换扩增、核酸外切酶Ill辅助信号扩增、杂交链反应、解旋酶依赖性扩增、等温环链置换聚合、多重置换扩增、基于引发酶的全基因组扩增、滚环扩增和全基因组扩增。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述等温扩增：a)选自重组酶聚合酶扩增、链置换扩增、滚环扩增和多重置换扩增；所述Cas效应子是Cas12a，或者b)选自环介导的等温扩增、解旋酶依赖性扩增、链置换扩增和滚环扩增；所述Cas效应子是Cas12b。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述掩蔽构建体抑制可检测阳性信号的产生直到被切割，或者掩蔽可检测阳性信号直到所述掩蔽构建体被切割。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述掩蔽构建体包含淬灭的荧光核酸探针，如ssDNA探针、dsDNA或RNA探针。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述靶标是DNA或RNA，如病毒DNA或RNA。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒是SARS
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2病毒、人腺病毒(HAdV)、单纯疱疹病毒(HSV)或爱泼斯坦
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巴尔病毒(EBV)。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述分配是基于微流体的、基于液滴的或基于膜的，优选基于芯片的。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中将所述混合物分配至至少1,000个
区室中。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述指导物具有包含与所述一种或多种靶序列的错配的序列。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述等温扩增是热启动LAMP或RT
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LAMP反应和/或多重反应。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中：所述靶核酸是SARS
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2、HAdV、单纯疱疹病毒(HSV)或爱泼斯坦
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巴尔病毒核酸；所述等温扩增是：a)重组酶聚合酶扩增；所述Cas效应子是Cas12a，或b)LAMP或RT
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LAMP；所述Cas效应子是Cas12b；所述至少一种指导多核苷酸是crRNA；将所述混合物分配至至少10,000个区室中并且是基于芯片的；并且所述掩蔽构建体包含淬灭的荧光ssDNA探针。16.一种用于检测受试者中疾病的存在和/或严重程度的方法，所述方法包括以下步骤：a)形成混合物，所述混合物包含：来自所述受试者的含有核酸的样品；用于扩增一种或多种靶疾病核酸序列的等温扩增反应试剂；Cas12a、Cas12b、Cas13b或Cas14效应子或其变体；含有DNA靶向序列并且被设计为与所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：武晓琳，余严军，卢冠达，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：