一种用于核酸检测的扩增体系和方法技术

本发明专利技术公开一种用于核酸检测的扩增体系和方法。所述的核酸扩增体系中包括末端磷酸标记的核苷酸底物，DNA聚合酶，碱性磷酸酶等。所述DNA聚合酶包含功能等价于或位置等价于9

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸检测的扩增体系和方法


[0001]本专利技术涉及一种用于核酸检测的扩增体系和方法，属于分子生物学领域，更具体的，属于核酸扩增与检测领域。

技术介绍

[0002]核酸分子的检测是很多体外诊断项目的重要组成和“金标准”，在疾控、诊疗、预后、环境监测、农业育种、病虫害监测等多领域发挥不可替代的作用。目前主流的检测以可实时定量的PCR为主，包括实时荧光定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR)方法。近些年来，恒温扩增技术也逐步发展，例如重组酶
‑
聚合酶恒温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，环介导的等温扩增技术(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)，滚换扩增(rolling
‑
circle amplification，RCA)等，因其检测时间短、反应条件简单、灵敏度高等优势，成为继PCR方法后又一类被广泛研究和使用的实时检测手段。这些检测方法的发光原理都可归结为两种，一种是利用核酸染料，在扩增产生新的核酸分子后，结合双链DNA产生可被检测的荧光；一种是利用探针法在扩增过程中产生荧光，例如PCR方法中的Taqman探针，探针上修饰有荧光基团和猝灭基团，利用带有外切活性的聚合酶，在扩增过程中水解和目标序列互补配对的探针，释放荧光基团，从而达到可检测目的。利用核酸染料的方法具有很高的普遍性，同样的试剂可以利用在多种目标核酸的扩增和检测中，且原料成本相对较低，然而其特异性低于探针法，染料的选取和加入量也可能直接影响扩增效率；探针法特异性更好，对扩增效率影响小，但需要针对不同目标核酸单独设计，在量产上相对局限，探针的水解依赖于酶的外切活性，定量检测很受试剂质量的影响，需要在严格的条件下进行反应，修饰的成本一般较高。因此，需要开发一种不依赖于探针的、操作便捷、更加灵敏和快速的核酸检测体系和检测方法。

技术实现思路

[0003]针对以上问题，本专利技术提供了一种可在qPCR、dPCR以及类似恒温扩增检测中使用的新的扩增体系与方法，比染料法和探针法的理论检测出时间更短，适用于大多数目标核酸扩增和检测。
[0004]具体的，本专利技术的第一方面公开一种用于核酸检测的扩增体系，其特征在于，包括：
[0005]1)末端磷酸标记的核苷酸底物；或末端磷酸标记的核苷酸与未标记核苷酸的混合物；
[0006]2)至少一种DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包含功能等价于或位置等价于9
°
N DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中的选自Lys464，Gln483，Glu578，Glu580的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸替换突变，和/或Leu408，Ala485中的一个或两个替换突变；
[0007]3)碱性磷酸酶；
[0008]4)缓冲液；所述缓冲液中包含至少一种二价金属阳离子，所述二价金属阳离子包括Mg
2+
离子；
[0009]5)用于扩增靶核酸的引物；
[0010]6)待检测样品，其中可能包含靶核酸。
[0011]根据优选的实施方式，所述聚合酶功能等价于或位置等价于Leu408的位置处的所述替换突变包含突变为Ala、Phe、Tyr、His、Gln、Asn或Gly的突变。
[0012]根据优选的实施方式，所述聚合酶功能等价于或位置等价于Ala485的位置处的所述替换突变包含突变为Leu、Lys、Phe、Arg、Glu、Ile、Trp、His或Thr的突变。
[0013]根据优选的实施方式，所述聚合酶功能等价于或位置等价于Gln483的位置处的所述替换突变包含突变为Gly、Pro、Ser、Phe或Cys的突变。
[0014]根据优选的实施方式，所述聚合酶功能等价于或位置等价于Lys464的位置处的所述替换突变包含突变为Leu、Ile、Pro、Phe或His的突变。
[0015]根据优选的实施方式，所述聚合酶功能等价于或位置等价于Glu580的位置处的所述替换突变包含突变为Arg、His、Gln、Asn、Cys、Lys或Trp的突变。
[0016]根据优选的实施方式，所述聚合酶功能等价于或位置等价于Glu578的位置处的所述替换突变包含突变为Gly、Ala、Gln、His、Lys、Met、Arg或Trp的突变。
[0017]根据优选的实施方式，碱性磷酸酶包括，小牛肠碱性磷酸酶(CIP)、碱性磷酸酶(TAP)、虾碱性磷酸酶(SAP)、细菌碱性磷酸酶(BAP)、海洋红嗜热盐菌碱性磷酸酶。
[0018]根据优选的实施方式，末端磷酸标记的核苷酸可以作为DNA聚合酶或RNA聚合酶的底物，被DNA聚合酶或RNA聚合酶识别并掺入到DNA或RNA链中去，并释放出标记的多聚磷酸酯，标记的多聚磷酸酯具有独立的可检测的信号。
[0019]根据优选的实施方式，标记的多聚磷酸酯中的标记是生荧光染料或者生色团。
[0020]根据优选的实施方式，末端磷酸荧光标记的核苷酸被聚合酶和碱性磷酸酶分解后释放出荧光基团，在激发光照射时显著发出荧光信号。
[0021]根据优选的实施方式，末端磷酸生色团标记的核苷酸被聚合酶和碱性磷酸酶分解后产生肉眼可见的颜色变化，从而可被比色判断。
[0022]本专利技术还公开一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：如第一方面任一项实施方式所述的
[0023]1)末端磷酸标记的核苷酸底物；或末端磷酸标记的核苷酸与未标记核苷酸的混合物；
[0024]2)至少一种DNA聚合酶，所述聚合酶包含功能等价于或位置等价于9
°
N DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中的选自Lys464，Gln483，Glu578，Glu580的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸替换突变，和/或Leu408，Ala485中的一个或两个替换突变；
[0025]3)碱性磷酸酶；
[0026]4)缓冲液；所述缓冲液中包含至少一种二价金属阳离子，所述二价金属阳离子包括Mg
2+
离子；
[0027]5)用于扩增靶核酸的引物。
[0028]优选地，试剂盒还包括核酸提取试剂、阴性质控品、阳性质控品中的一种或多种。
[0029]本专利技术的还公开一种核酸检测方法，其特征在于，包括：
[0030](A).配制如第一方面任一项实施方式所述的扩增体系；
[0031](B).对所述扩增体系进行扩增反应；
[0032](C).在扩增反应的同时或扩增反应完成后检测末端磷酸荧光基团标记的核苷酸底物可能产生的荧光或颜色变化；
[0033](D).对靶核酸进行定性分析或定量分析。
[0034]根据优选的实施方式，所述扩增反应包括：普通PCR，实时荧光定量PCR(qPCR)，数字PCR(dPCR)，滚环扩增(RCA)，多重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸检测的扩增体系，其特征在于，包括：1)末端磷酸标记的核苷酸底物；或末端磷酸标记的核苷酸与未标记核苷酸的混合物；2)至少一种DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包含功能等价于或位置等价于9
°
N DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中的选自Lys464，Gln483，Glu578，Glu580的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸替换突变，和/或Leu408，Ala485中的一个或两个替换突变；3)碱性磷酸酶；4)缓冲液；所述缓冲液中包含至少一种二价金属阳离子，所述二价金属阳离子包括Mg
2+
离子；5)用于扩增靶核酸的引物；6)待检测样品，其中可能包含靶核酸。2.根据权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，功能等价于或位置等价于Glu580的位置处的所述替换突变包含突变为Arg、His、Gln、Asn、Cys、Lys或Trp的突变；功能等价于或位置等价于Glu578的位置处的所述替换突变包含突变为Gly、Ala、Gln、His、Lys、Met、Arg或Trp的突变；功能等价于或位置等价于Gln483的位置处的所述替换突变包含突变为Gly、Pro、Ser、Phe或Cys的突变；功能等价于或位置等价于Lys464的位置处的所述替换突变包含突变为Leu、Ile、Pro、Phe或His的突变；功能等价于或位置等价于Ala485的位置处的所述替换突变包含突变为Leu、Lys、Phe、Arg、Glu、Ile、Trp、His或Thr的突变；功能等价于或位置等价于Leu408的位置处的所述替换突变包含突变为Ala、Phe、Tyr、His、Gln、Asn或Gly的突变。3.根据权利要求1或2任一项所述的扩增体系，其特征在于，所述末端磷酸标记的核苷酸可以作为DNA聚合酶或RNA聚合酶的底物，被DNA聚合酶或RNA聚合酶识别并掺入到DNA或RNA链中去，并释放出标记的多聚磷酸酯，所述标记的多聚磷酸酯具有独立的可检测的信号。4.根据权利要求3所述的扩增体系，其特征在于，所述标记的多聚磷酸酯中的标记是生荧光染料或者生色团。5.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1
‑
4任一项所述的1)末端磷酸标记的核苷酸底物；或末端磷酸标记的核苷酸与未标记核苷酸的混合物；2)至少一种DNA聚合酶，所述聚合酶包含功能等价于或位置等价于9
°
N DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中的选自Lys464，Gln483，Glu578，Glu580的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个或四个氨基酸替换突变，和/或Leu408，Ala485中的一个或两个替换突变；3)碱性磷酸酶；4)缓冲液；所述缓冲液中包含至少一种二价...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙悦，王选，段海峰，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：