高效小体积核酸合成制造技术

本公开大体上涉及用于产生核酸分子的组合物和方法。在一些方面，本发明专利技术允许微量生成核酸分子，任选地接着将这些核酸分子组装成较大分子。在一些方面，本发明专利技术允许高效产生核酸分子(例如，大核酸分子，如基因组)。

High efficiency small volume nucleic acid synthesis

The present disclosure generally relates to a composition and method for producing nucleic acid molecules. In some respects, the invention allows a trace of nucleic acid molecules to be selected and then elected to assemble the nucleic acid molecules into larger molecules. In some respects, the invention allows the efficient production of nucleic acid molecules (for example, large nucleic acid molecules, such as the genome).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高效小体积核酸合成
本公开大体上涉及用于产生核酸分子的组合物和方法。在一些方面，本专利技术允许微量生成核酸分子，任选地接着将这些核酸分子组装成较大分子，如美国申请第13/627,819号中所公开，所述参考文献以引用的方式特此并入。在一些方面，本专利技术允许高效产生核酸分子(例如，大核酸分子，如基因组)。
技术介绍
核酸分子的产生可相当简单或复杂，取决于如有待产生的核酸分子的类型等因素。举例来说，历史上，如引物等短的单链核酸分子已通常通过化学合成来生成(参见例如美国专利第5,837,858号，其公开内容以引用的方式并入本文中)。另外，较长核酸分子已通常通过聚合酶链反应(PCR)来生成。PCR的一个缺点是一般需要模板核酸。许多核酸合成方法具有有限的大核酸分子从头生成的能力。本专利技术的一个方面是为了解决这一限制。此外，用于基因合成的核酸分子通常是使用昂贵的自动化机器产生的，生产量有限。出于这个原因，正在研究替代性方法，如使用微阵列作为用于基因合成的核酸分子来源。微阵列可在小表面上具有数十万个不同的核酸分子并且可以极低的成本制造。然而，基于微阵列的核酸分子合成方法可遭受如每一点产生的核酸分子量少等缺陷。这对于杂交分析用途可能不存在问题，杂交分析是最初开发二维微阵列的应用。然而，当二维微阵列用于基因合成(即，在平面表面上制造核酸分子)时，其可能缺乏至少两个重要特征。第一，核酸分子的数量可能不是大到足以组装片段，如可用于基因组装的片段。在某些情况下，仅可获得数阿托摩尔(attomole)。出于这个原因，所生成的核酸分子通常需要通过PCR复制以达到可用于片段组装的数量。此外，核酸分子的数量可因在合成之后可用于降解核酸分子的合成试剂(如酸)而进一步减少。第二，难以从微阵列单独释放合成的核酸分子或释放于一个片段组装所需的池中。实际上，核酸分子通常被一起释放，常常产生具有数千个不同核酸分子的复杂池，在无后处理的情况下可能不适于基因合成。因此，为了利用这些池，常常需要像拨出PCR(dial-outPCR)或测序等复杂方法以鉴别和扩增所期望的核酸分子。
技术实现思路
本专利技术部分涉及用于核酸分子合成的组合物和方法。本专利技术另外涉及用于获取合成的核酸分子的组合物和方法，以及用于组装核酸分子以形成如质粒、染色体和基因组等分子的组合物和方法。在一些方面，本专利技术涉及用于无模板引导的核酸分子合成的多孔板。在一些实施例中，所述板包含位于所述板的多个孔的每一个中的珠粒(例如，磁性珠粒)和存在于所述多个孔的一个或多个中的电化学生成酸(EGA)。替代在一个或多个孔中具有EGA或除了在一个或多个孔中具有EGA之外，板孔可含有在别处陈述的与核酸分子的合成相关联的其它试剂。在本文所公开的某些实施例中，光生酸(PGA)可替代EGA或除了EGA之外存在于多个孔的一个或多个中。EGA或PGA用于去除保护基(例如，DMT)，随后紧接着将酰胺添加到附接于固体支撑物的核酸分子。在一些实施例中，至少一种质子载体，如2-氯-6-甲基吡啶或二苯胺，可存在于具有EGA或PGA的溶液中。至少一种质子载体可通过接受来自EGA或PGA的质子，从而调节溶液的酸度来用于降低DNA降解的作用。在一个方面，PGA用于生成经组装的核酸的方法中，所述方法包含a)合成多个核酸分子，其中每个核酸分子是在板或微芯片的孔中制备，其中所述孔可操作地连接到用于产生PGA的光源并且任选地含有质子载体，如2-氯-6-甲基吡啶或二苯胺；b)组合(a)中生成的一些或全部核酸分子以产生池；c)接合(b)中所形成的池中所存在的一些或全部核酸分子以形成多个较大核酸分子；d)从(c)中所形成的多个较大核酸分子排除含有序列错误的核酸分子以产生经纠错的核酸分子池；和e)组装所述经纠错的核酸分子池中的核酸分子以形成所述经组装的核酸分子。用于本专利技术实践中的珠粒大小可大幅变化，但是包括直径在0.01μm与100μm之间、在0.005μm与100μm之间、在0.005μm与10μm之间、在0.01μm与100μm之间、在0.01μm与1,000μm之间、在1.0μm与2.0μm之间、在1.0μm与100μm之间、在2.0μm与100μm之间、在3.0μm与100μm之间、在0.5μm与50μm之间、在0.5μm与20μm之间、在1.0μm与10μm之间、在1.0μm与20μm之间、在1.0μm与30μm之间、在10μm与40μm之间、在10μm与60μm之间、在10μm与80μm之间或在0.5μm与10μm之间的珠粒。在某些实施例中，珠粒的直径可在30μm与40μm之间，如31μm或32μm或33μm或34μm或35μm的直径。所属领域的技术人员应认识到，当固体粒子降至低于特定大小时，它们开始获得流体属性(例如，形成胶态悬浮体的等效物)。因此，在一些情况下(例如，在使用直径小于约100nm的珠粒的情况下)，可能需要以流体形式处理珠粒。这可能意味着例如通过搅动、洗涤或通过使用表面活性剂从表面、孔或磁尖去除珠粒。在本专利技术的特定实施例中，可依据孔的大小选择珠粒大小以使得仅一个单一珠粒占据孔。在其它实施例中，不止一个珠粒(或其它形状的核酸合成衬底)可在一些或全部孔中。在一些情况下，每孔的珠粒数可为一个、两个至二十个、两个至三十个、两个至十个、四个至二十个、四个至十个、四个至五十个等。在某些实施例中，用于合成核酸的多孔板的每个孔被配置成容纳直径为约35-40μm、或约35μm或约29至33μm的单分散珠粒。在某些实施例中，单分散珠粒是由合成聚合物(如聚苯乙烯)构成。孔数也可大幅变化并且受以下因素限制，如有待产生的核酸量、时间限制、经济因素、技术因素(如可制造性)和与用途相关的机械因素(例如，(磁性)珠粒提取器的大小下限)。因此，依据各种因素而定，所期望的合成规模可变化并且可调节孔数以适应所期望的合成规模。在任何情况下，孔数可为例如10至10,000,000、10至5,000,000、10至2,000,000、10至1,000,000、10至800,000、10至650,000、10至500,000、500至500,000、500至200,000、10至50,000、1,000至500,000、10,000至500,000、20,000至500,000、1,000至50,000、10至50,000、10至25,000、10至10,000、10至5,000、10至2,500、100至50,000、100至25,000、100至10,000、100至5,000、100至2,500、350至50,000、350至25,000、350至10,000、350至5,000、350至2,500、1000至50,000、1000至25,000、1000至10,000、1000至5,000、1000至2,500、1,500至50,000、1,500至25,000、1,500至10,000、1,500至5,000、1500至2,500、20,000至50,000、20,000至40,000或约35,000的数目。在某些实施例中，孔数可为例如35,440个。在某些其它示例性实施例中，孔数可为例如约196,000个，如196,160个，或例如约9,000个，如90本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒的方法，其中核酸分子附接到所述珠粒，所述方法包含：在排列于所述经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述经流体填充的孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述经流体填充的孔的顶部或将所述珠粒提升到所述经流体填充的孔的顶部。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.09 US 62/089,590;2015.04.09 US 62/145,3591.一种用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒的方法，其中核酸分子附接到所述珠粒，所述方法包含：在排列于所述经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述经流体填充的孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述经流体填充的孔的顶部或将所述珠粒提升到所述经流体填充的孔的顶部。2.根据权利要求1所述的方法，其另外包含用珠粒收集装置收集已上升到所述经流体填充的孔的顶部的珠粒。3.根据权利要求1或2所述的方法，其另外包含将所收集的珠粒转移到第一多孔收集板的孔中。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述流体包含水性或非水性缓冲溶液。5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述流体包含水、甲醇、乙腈和Net4pTsＯ。6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中所述第一电极是由铂构成并且所述电压为约0.1至约100伏。7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的方法，其中所述第二电极排列在所述第一电极上方。8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述微芯片包含封盖，其可经操作以在所述微芯片的顶表面上形成并且可经操作以提供经所述孔的流体流动路径。9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中所述第二电极是在所述封盖中形成。10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其中所述微芯片的每个孔可由控制器个别寻址。11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的方法，其中所述微芯片是互补金属氧化物半导体(“CMOS”)芯片。12.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中所述珠粒是由以下各物构成：合成聚合物、经改性的天然存在的聚合物、玻璃、受控微孔玻璃、磁性受控微孔玻璃、磁性珠粒、陶瓷或一种或多种金属。13.根据权利要求3至12中任一权利要求所述的方法，其中所述第一多孔收集板包含多个孔结构和在所述多个孔结构的顶表面上或在所述多个孔结构内形成的流体渗透结构。14.根据权利要求3至13中任一权利要求所述的方法，其中所述第一多孔收集板包含多个孔结构并且另外包含第二多孔收集板，其中所述第二多孔收集板包含多个孔结构和在所述多个孔结构的底表面上形成的流体渗透结构，其中所述第二多孔收集板置于所述第一多孔收集板的顶部上以使得所述第二多孔收集板的多个孔结构与所述第一多孔收集板的多个孔结构对准。15.根据权利要求2至14中任一权利要求所述的方法，其中所述珠粒收集装置包含针结构，其可经操作以1)将来自所述核酸分子合成微芯片的珠粒放置于所述第一多孔收集板的孔中，和/或2)将流体递送到所述第一多孔收集板中放置所述珠粒的孔。16.根据权利要求3至15中任一权利要求所述的方法，其另外包含以一个或多个自由度移动所述珠粒收集装置以将所述珠粒收集装置中收集的珠粒递送到所述第一多孔收集板的多个孔中。17.根据权利要求3至16中任一权利要求所述的方法，其中所述微芯片经编程以从所述微芯片中所关注的特定孔提取所述珠粒并且经由所述珠粒收集装置将所述珠粒递送到所述第一多孔收集板的多个孔的可寻址的孔中。18.根据权利要求3至17中任一权利要求所述的方法，其中所述第一多孔收集板的每个孔的总体积在1与约200μl之间。19.一种用于合成核酸分子的系统，所述系统包含：微芯片，包含上面形成的多个孔结构，所述多个孔结构的每个孔大小设定成容纳用于合成所述核酸分子的珠粒，其中每个孔中已形成在孔底部可由控制器单独控制的第一电极；和封盖构件，排列在所述微芯片的顶部上并包含其中形成的流体通道以提供所述珠粒的流体路径，其中所述封盖构件包含第二电极，其中所述控制器可经操作以在所述第一电极与所述第二电极之间提供电压，所述电压足以致使孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述孔的顶部或将所述珠粒提升到所述经流体填充的孔的顶部。20.根据权利要求19所述的系统，其另外包含珠粒收集装置，可经操作以收集从所述孔移出的珠粒。21.根据权利要求19或20所述的系统，其另外包含第一多孔收集板，可经操作以接收从所述珠粒收集装置收集的珠粒。22.根据权利要求19至21中任一权利要求所述的系统，其中所述流体包含水性或非水性缓冲溶液。23.根据权利要求19至22中任一权利要求所述的系统，其中所述流体包含水、甲醇、乙腈和Net4pTsO。24.根据权利要求19至23中任一权利要求所述的系统，其中所述第一电极是由铂构成并且所述电压为约0.1至约100伏。25.根据权利要求19至24中任一权利要求所述的系统，其中所述第二电极排列在所述第一电极上方。26.根据权利要求19至25中任一权利要求所述的系统，其中所述微芯片的每个孔的深度在约40与约60μm之间。27.根据权利要求19至26中任一权利要求所述的系统，其中所述微芯片是互补金属氧化物半导体(“CMOS”)芯片。28.根据权利要求19至27中任一权利要求所述的系统，其中所述珠粒是由以下各物构成：合成聚合物、经改性的天然存在的聚合物、玻璃、受控微孔玻璃、磁性受控微孔玻璃、磁性珠粒、陶瓷或一种或多种金属。29.根据权利要求21至28中任一权利要求所述的系统，其中所述第一多孔收集板包含具有多个孔结构和在所述多个孔结构的顶表面上或在所述多个孔结构内形成的流体渗透结构的板。30.根据权利要求20至29中任一权利要求所述的系统，其中所述珠粒收集装置包含针结构，其可经操作以将来自所述核酸分子合成微芯片的珠粒放置于所述第一多孔收集板的孔中，并将流体递送到放置所述珠粒的孔。31.根据权利要求20至30中任一权利要求所述的系统，其另外包含控制器，可经操作以一个或多个自由度移动所述珠粒收集装置，将所述珠粒收集装置中收集的珠粒递送到所述第一多孔收集板的多个孔中。32.根据权利要求20至31中任一权利要求所述的系统，其中所述微芯片经编程以从所述微芯片中所关注的特定孔提取所述珠粒并且经由所述珠粒收集装置将所述珠粒递送到所述第一多孔收集板的多个孔的可寻址的孔中。33.根据权利要求21至32中任一权利要求所述的系统，其中所述第一多孔收集板的每个孔的总体积在1μl与约200μl之间。34.一种非瞬时性计算机可读存储介质，其经通过处理器可执行的指令编码，用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒，其中核酸分子任选地附接到所述珠粒，所述指令包含用于以下的指令：在排列于所述经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述经流体填充的孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述孔的顶部或将所述珠粒提升到所述经流体填充的孔的顶部。35.一种用于从合成核酸分子的微芯片的经流体填充的孔移出珠粒的系统，其中核酸分子附接到所述珠粒，所述系统包含：处理器；和经处理器可执行指令编码的存储器，所述指令用于：在排列于所述经流体填充的孔的底部的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述经流体填充的孔中的流体进行电解，在所述流体中产生一个或多个气泡以连同所述珠粒一起上升到所述孔的顶部或将所述珠粒提升到所述经流体填充的孔的顶部。36.一种用于从具有多个经流体填充的孔的用于合成核酸分子的微芯片选择性移出一个或多个珠粒的方法，其中所述多个孔中的每一个包含在孔底部形成的电极并且所述一个或多个珠粒中的每个珠粒占据所述微芯片上的单个孔，所述方法包含：鉴别含有有待从所述微芯片移出的一个或多个珠粒的一个或多个孔；在已鉴别的一个或多个孔中的第一电极与第二电极之间提供电压，其中所述电压足以致使所述一个或多个经流体填充的孔中的流体进行电解并在...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·珀尔曼，P·库恩，F·诺特卡，A·泽德勒，K·海尔，A·特里弗泽，G·冯纳姆，F·卡岑，K·安德森，X·梁，
申请(专利权)人：生命技术公司，赛默飞世尔科技金尔特有限公司，生命技术股份公司，
类型：发明
国别省市：美国,US