次黄嘌呤核苷酸的生产方法技术

本发明专利技术提供一种次黄嘌呤核苷酸的生产方法，所述方法包括采用固定于阴离子树脂的腺苷酸脱氨酶催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷酸。该方法以腺苷酸为底物，原料供应充足，而且对设备要求低，分离提取方便，能够实现次黄苷酸的半连续生产，底物方便易得且转化彻底，成本较低。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种，所述方法包括采用固定于阴离子树脂的腺苷酸脱氨酶催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷酸。该方法以腺苷酸为底物，原料供应充足，而且对设备要求低，分离提取方便，能够实现次黄苷酸的半连续生产，底物方便易得且转化彻底，成本较低。【专利说明】
本专利技术属于生物合成领域，具体涉及一种。
技术介绍
次黄嘌呤核苷酸，又名次黄苷酸、肌苷酸或羟基嘌呤核苷酸，简称5，-1MP,是嘌呤核苷酸体内代谢的重要中间代谢产物，是腺苷酸与鸟苷酸代谢的纽带，可实现腺苷酸与鸟苷酸的相互转化，以保持体内嘌呤核苷酸代谢的平衡。次黄嘌呤核苷酸参与体内能量代谢和核蛋白的合成，活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，使处于低能、缺氧状态下的组织细胞能够继续顺利地进行代谢，以及活化肝功能，使受损害肝细胞加快修复，并刺激体内产生抗体，适用于白细胞和血小板减少症、心肌损伤、肝炎及肝硬化。同时，次黄嘌呤核苷酸还是呈味核苷酸中的一种，与鸟甘酸合用可以显著增强味精的鲜味效果。目前，次黄嘌呤核苷酸主要有化学合成法、天然原料提取法、微生物发酵法、发酵-催化结合法以及酶转化法等生产方法。而以上几种生产方法都有一定的缺陷。化学合成法由于产率低、副产物多且分离困难、设备要求较高等因素而不利于工业生产；天然原料提取法由于受到原料来源限制而不能大规模生产，难以满足社会需求；微生物发酵法及发酵-催化结合法以廉价原料实现次黄苷酸的生产，然而微生物积累的次黄苷酸的量是有限的，从而导致发酵液中次黄苷酸的浓度偏低，给后期的分离提取造成困难；酶转化法由于酶固有的缺陷而受到限制。这些缺陷导致次黄嘌呤核苷酸供应紧缺。专利申请(CN1406273A)公开了一种利用工业微生物菌株一产氨棒杆菌CJIP009(KCCM-10226)的突变体生产次黄嘌呤核苷酸的生产工艺。其中烧瓶发酵与5L发酵罐中次黄苷酸的积累量可分别达到19.lg/L、70.3g/L，即便如此，从7.03%的溶液中分离提取次黄嘌呤核苷酸依然相当困难。`
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的主要目的在于提供一种，该方法以腺苷酸为底物，原料供应充足，而且对设备要求低，分离提取方便，能够实现次黄苷酸的半连续生产，底物方便易得且转化彻底，成本较低。本专利技术提供一种黄嘌呤核苷酸的生产方法，所述方法包括采用固定于阴离子树脂的腺苷酸脱氨酶催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷酸。进一步地，所述阴离子树脂为以苯乙烯聚合物或丙烯酸聚合物为骨架，以伯胺基、叔胺基或季胺基为功能基团的树脂；优选地，所述阴离子树脂为以苯乙烯聚合物为骨架，以季氨基为功能基团的树脂；进一步优选地，所述阴离子树脂为以苯乙烯-二乙烯苯为骨架，以叔氨基为功能基团的树脂；或者以苯乙烯-二乙烯苯为骨架，以季铵基为功能基团的树脂。进一步优选地，所述阴离子树脂为Amberlite IRA-900、Amberlite IRA-93或Amberlite IRA-400 树脂。进一步地，所述生产方法具体包括:步骤1，对阴离子树脂进行预处理，并将腺苷酸脱氨酶固定于阴离子树脂；步骤2，将底物腺苷酸溶解至去离子水中，再加入步骤I中得到的固定化腺苷酸脱氨酶，使腺苷酸反应生成次黄嘌呤核苷酸。进一步地，所述步骤I具体包括:步骤la，将阴离子树脂采用醇溶液浸泡、洗涤，抽滤，然后经强酸溶液浸泡、洗涤、抽滤，再经强碱溶液浸泡、洗涤、抽滤；然后再采用中性盐酸盐溶液浸泡、洗涤、抽滤，得到氯离子型阴离子树脂；优选地，所述醇溶液为无水甲醇或无水乙醇，优选无水乙醇；优选地，所述强酸溶液为HCl或H2SO4溶液；所述强酸溶液的浓度优选I-3M，更优选IM ;所述强酸溶液优选IM的HCl溶液；优选地，所述强碱溶液为NaOH或KOH溶液；所述强碱溶液的浓度优选I-3M，更优选IM ;所述强碱溶液优选IM的NaOH溶液；优选地，所述中性盐酸盐溶液为NaCl或KCl溶液；所述中性盐酸盐溶液的浓度为0.5-3M，优选IM ;所述中性盐酸盐溶液优选IM的NaCl溶液。步骤lb，将得到的氯离子型阴离子树脂及腺苷酸脱氨酶溶液置于摇床上进行腺苷酸脱氨酶的固定化，设置温度20-35°C，取出后洗涤，使腺苷酸脱氨酶固定于树脂上；`优选地，在步骤Ib之前，将腺苷酸脱氨酶溶液置于缓冲溶液中，调节pH为5-8，优选PH为5-6 ;优选地，所述缓冲溶液为乙酸盐缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。进一步地，所述步骤2具体包括:将底物腺苷酸溶解至去离子水中，调节pH为5-8，优选pH为5-6，40-55°C预热10-30min,优选IOmin,再加入步骤I中得到的固定化腺苷酸脱氨酶,然后40-55°C保温，50-120转/分搅拌，使腺苷酸反应生成次黄嘌呤核苷酸；优选地，将底物腺苷酸溶解至去离子水中，采用I-3M的HCl溶液或3-6M的乙酸溶液，优选3M的HCl溶液调节pH。进一步地，所述底物腺苷酸的浓度为100-300g/L。进一步地，所述生产方法还包括阴离子树脂的再生步骤。进一步地，所述再生包括以碱洗脱阴离子树脂，然后再采用NaCl溶液，优选IM的NaCl溶液进行浸泡、洗涤、抽滤，将羟基型阴离子树脂转变为氯离子型阴离子树脂。以下为本专利技术技术方案的详细描述:本专利技术的基本原理如下:腺苷酸脱氨酶蛋白分子的等电点在5.6左右，表明在中性及微酸性环境中蛋白质分子带负电荷的状态为优势形式，可以与阳离子形成离子键。利用此机理，本专利技术将选择的阴离子树脂来固定腺苷酸脱氨酶，以达到高效的固酶效果，从而利用固定化腺苷酸脱氨酶实现次黄嘌呤核苷酸的半连续生产。其中，本专利技术采用的腺苷酸脱氨酶为已商品化的脱氨酶，该酶可由蜂蜜曲霉发酵纯化制得，单位酶活为10U/ml酶液(IU=实验条件下每分钟内生成Img次黄嘌呤核苷酸所需的酶量)。本专利技术对选用的阴离子树脂进行醇-碱-酸-碱处理，即依次用醇、强碱、强酸、强碱对阴离子树脂进行预处理，去除阴离子树脂在制备过程中残留的醇、强酸及强碱可溶性杂质，最后用盐酸盐溶液对阴离子树脂进行转型，然后将转型后的树脂置于PH5-6的乙酸盐缓冲溶液、碳酸氢盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中进行腺苷酸脱氨酶的固定化，由于腺苷酸脱氨酶蛋白分子在中性及微酸性的溶液环境中带负电，因此可以与阴离子树脂表面的Cl—进行交换，实现酶蛋白的固定化。具体的固定化步骤如下:步骤A，称取一定质量的阴离子树脂于容器中，加入无水醇溶液，浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液中无醇残留，然后抽滤，其中所述无水醇醇溶液为无水甲醇或无水乙醇，优选无水乙醇；步骤B，将步骤A中得到的树脂用I-3M优选IM的强碱溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈PH中性，然后抽滤，其中所述强碱溶液为NaOH或KOH溶液，优选IM的NaOH溶液；步骤C，将步骤B中得到的树脂用I-3M优选IM的强酸溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈PH中性，然后抽滤，其中所述强酸溶液为HCl或H2SO4溶液，优选IM的HCl溶液；步骤D，将步骤C中得到的树脂用I-3M优选IM的强碱溶液浸泡过夜，采用去离子水洗涤至洗脱液呈PH中性，然后抽滤，其中所述强碱溶液为NaOH或KOH溶液，优选IM的NaOH溶液； 步骤E，将步骤D中得到的树脂用0.5-3M优选IM的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种次黄嘌呤核苷酸的生产方法，所述方法包括采用固定于阴离子树脂的腺苷酸脱氨酶催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，曹治，陈勇，陈晓春，吴菁岚，谢婧婧，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：