一种极速PCR（聚合酶链式反应）扩增和终点检测方法技术

本发明专利技术提供了一种可在短时间内完成的极速PCR（聚合酶链式反应）扩增和可视化的终点检测的方法，包括如下步骤：I．极速PCR扩增中，极速PCR扩增包含（a）变性和（b）退火两个阶段，单个循环时间少于20秒；在（a）变性阶段，变性温度控制在85‑98℃；在（b）退火阶段，退火温度控制在40‑72℃，引物的浓度为0.1‑1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5‑30U，镁离子的浓度为1‑3mM；II.扩增产物的检测中，通过荧光物质确定样本的检测结果。本发明专利技术加快了扩增速度，提高了扩增效率；检测阶段可视化地确定检测结果，简便易行，避免了开盖造成的交叉污染，避免对人体的危害，也降低了检测成本。

【技术实现步骤摘要】
一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法
本专利技术涉及核酸扩增和检测
，具体涉及一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法。
技术介绍
PCR(聚合酶链式反应)作为黄金标准，被广泛应用于医学诊断、食品安全检测等领域。对于传统的PCR扩增而言，每个循环需要提供三个反应温度及相应的反应时间。每个循环包括变性(95℃，10s)、退火(50℃～65℃，30s)、延伸(72℃，1min)三个阶段，为了使反应达到平衡，须提供精密温控的热块，且每个阶段保持相应时长，因此完成整个PCR反应至少需要一个小时。然而，现实中的物理设备不会发生瞬时的温度变化，以及考虑到传质，上述提到的“平衡范例”并不能与现实中的物理设备实现良好的契合。况且，此“平衡范例”也并不完全适用于动力学原理，一旦发生引物退火，则酶延伸紧随其后，即模板变性，引物退火和聚合酶延伸可能短时重叠，其反应速率随着温度的变化而变化。可见，在每个循环中保持三个温度的恒定并不是必须的。此外，对于扩增产物的检测，传统的方法采用凝胶电泳，费时费力，对人体存在危害，尤为严重的是开盖易造成交叉污染。另外，实时荧光定量PCR需要集成昂贵的荧光设备，大大提高了检测成本。因此，开发一种更为便携、快速、无需集成热块的PCR扩增和现场检测的方法十分必要。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种可在短时间内完成并可视化检测的极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测的方法。为了达到上述目的，本专利技术可以通过以下技术方案来实现：一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，包括如下步骤：I.极速PCR扩增极速PCR扩增由(a)变性和(b)退火两个阶段组成，单个循环时间少于20秒；在(a)变性阶段，变性温度控制在85-98℃；在(b)退火阶段，退火温度控制在40-72℃，引物的浓度为0.1-1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5-30U，镁离子的浓度为1-3mM；II.扩增产物的检测通过荧光物质确定样本的检测结果。所述扩增产物的检测可以采用以下步骤：在极速PCR扩增完成后，将事先滴加在反应盖上的高浓度荧光染料通过离心方式加入到扩增液中，在紫外灯的照射下观察，确定样本的检测结果。扩增产物的检测也可以采用以下步骤：在极速PCR扩增前向扩增体系中加入浓度为0.01-1μM的荧光探针，待扩增完成后在凝胶电泳仪或荧光设备上拍照成像并进行灰度值提取，通过比值分析确定样本的检测结果。优选地，极速PCR扩增中，变性温度控制在90-98℃。优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在45-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在50-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在55-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在55-60℃。优选地，极速PCR扩增中，引物的浓度为0.2-0.8μM；更优选地，极速PCR扩增中，引物的浓度为0.4-0.5μM。优选地，极速PCR扩增中，热稳定性聚合酶的浓度为10-20U；更优选地，极速PCR扩增中，热稳定性聚合酶的浓度为10-15U。优选地，极速PCR扩增中，镁离子的浓度为1.5-2mM。优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于10秒；更优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于7.5秒；更优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于5秒。当单个循环时间小于5秒时，优选地，扩增子的长度小于300bp；更优选地，扩增子的长度小于250bp；更优选地，扩增子的长度小于200bp。优选地，所述热稳定性聚合酶为TaqHS,扩增原料包含dUTP，镁离子的浓度为2-3mM。优选地，扩增产物的检测中，荧光染料包括SYBRGreenI、Ethidiumbromide、Gold、SYTO、EvaGreen等双链DNA荧光嵌入荧光染料。优选地，扩增产物的检测中，荧光探针包括水解探针、分子信标、双链DNA荧光嵌入染料、钙黄绿素和锰离子等。优选地，荧光探针的浓度为0.01-1μM；更优选地，荧光探针的浓度为0.03-1μM；更优选地，荧光探针的浓度为0.05-0.5μM；更优选地，荧光探针的浓度为0.1-0.4μM。本专利技术的第二个目的是提供一种可在短时间内完成的极速PCR(聚合酶链式反应)扩增方法。为了达到上述目的，本专利技术可以通过以下技术方案来实现：一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增方法，包括如下步骤：极速PCR扩增包含(a)变性和(b)退火两个阶段，单个循环时间少于20秒；在(a)变性阶段，变性温度控制在85-98℃；在(b)退火阶段，退火温度控制在40-72℃，引物的浓度为0.1-1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5-30U，镁离子的浓度为1-3mM。优选地，极速PCR扩增中，变性温度控制在90-98℃。优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在45-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在50-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在55-65℃；更优选地，极速PCR扩增中，退火温度控制在55-60℃。优选地，极速PCR扩增中，引物的浓度为0.2-0.8μM；更优选地，极速PCR扩增中，引物的浓度为0.4-0.5μM。优选地，极速PCR扩增中，热稳定性聚合酶的浓度为10-20U；更优选地，极速PCR扩增中，热稳定性聚合酶的浓度为10-15U。优选地，极速PCR扩增中，镁离子的浓度为1.5-2mM。优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于10秒；更优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于7.5秒；更优选地，极速PCR扩增的单个循环时间少于5秒。当单个循环时间小于5秒时，优选地，扩增子的长度小于300bp；更优选地，扩增子的长度小于250bp；更优选地，扩增子的长度小于200bp。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点：本专利技术是一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和可视化终点检测方法。扩增阶段通过对扩增体系的浓度、温度、反应时间的控制，加快了扩增速度，提高了扩增效率，同时也能保证扩增子的长度；扩增阶段对浓度、温度、反应时间优选范围的选择，有助于检测阶段更清楚地识别样本的阴性或阳性表现。终点检测阶段通过无需开盖的离心方式加入荧光染料或在扩增前就加入荧光探针的方式，可视化地确定检测结果，简便易行，避免了开盖造成的交叉污染，避免对人体的危害，也降低了检测成本。附图说明图1是本专利技术一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例1终点可视荧光检测对GTS40-3-2转基因大豆检测结果图。图2是本专利技术一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例2终点可视荧光检测对GTS40-3-2转基因大豆检测结果图。图3是本专利技术一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例3终点可视荧光检测对GTS40-3-2转基因大豆样本检测结果图。图4是本专利技术一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例4终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果图。图5是本专利技术一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例5终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果图。图6是本专利技术一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法实施例6终点可视荧光检测对虾样本中的副溶血弧菌检测结果图。图7是本专利技术一种极速PCR(聚合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于包括如下步骤：I.极速PCR扩增极速PCR扩增由(a)变性和(b)退火两个阶段组成，单个循环时间少于20秒；在(a)变性阶段，变性温度控制在85‑98℃；在(b)退火阶段，退火温度控制在40‑72℃，引物的浓度为0.1‑1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5‑30U，镁离子的浓度为1‑3mM；II.扩增产物的检测通过荧光物质确定样本的检测结果。

【技术特征摘要】
1.一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于包括如下步骤：I.极速PCR扩增极速PCR扩增由(a)变性和(b)退火两个阶段组成，单个循环时间少于20秒；在(a)变性阶段，变性温度控制在85-98℃；在(b)退火阶段，退火温度控制在40-72℃，引物的浓度为0.1-1μM，热稳定性聚合酶的浓度为5-30U，镁离子的浓度为1-3mM；II.扩增产物的检测通过荧光物质确定样本的检测结果。2.根据权利要求1所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于步骤II的检测方法为：在极速PCR扩增完成后，将事先滴加在反应盖上的高浓度荧光染料通过离心方式加入到扩增液中，在紫外灯的照射下观察，确定样本的检测结果。3.根据权利要求1所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于步骤II的检测方法为：在极速PCR扩增前向扩增体系中加入浓度为0.01-1μM的荧光探针，待扩增完成后在凝胶电泳仪或荧光设备上拍照成像并进行灰度值提取，通过比值分析确定样本的检测结果。4.根据权利要求1或2或3所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于：极速PCR扩增中，变性温度控制在90-98℃，退火温度控制在45-65℃。5.根据权利要求1或2或3所述的一种极速PCR(聚合酶链式反应)扩增和终点检测方法，其特征在于：极速PCR扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，王瑞，钱文娟，叶尊忠，应义斌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33