一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法，涉及分子诊断领域。本发明专利技术公开的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其包括针对选自Penta C和Penta D中的至少一种的内参微卫星位点扩增的内参引物，其可针对内参微卫星位点检测，将具有五核苷酸重复单元的Penta C和Penta D内参位点作为阳性质控，以指示待检样品是否被污染，提高检测结果的可信度。

A combination of nucleic acids, kits and methods for microsatellite instability detection

The invention discloses a nucleic acid combination, a kit and a method for microsatellite instability detection, which relates to the field of molecular diagnosis. The invention discloses a colorectal cancer with microsatellite instability of nucleic acid combination detection, including internal primers for C and Penta from Penta D in at least one reference microsatellite loci amplified, the microsatellite loci detected for reference, will have a five nucleotide repeat unit of Penta C and Penta D reference sites as a positive control, indicating that the sample is contaminated, improve the reliability of detection results.

【技术实现步骤摘要】
一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法
本专利技术涉及分子诊断领域，具体而言，涉及一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法。
技术介绍
结直肠癌(carcinomaofcolonandrectum，CRC)是一种常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤。随着人类社会的发展，人们的生活方式和生存环境发生了改变，生活压力日益增大，生存环境的污染日益严重，致使近年来结直肠癌的发病率呈现明显的上升趋势，而且发病年龄呈现年轻化态势。遗传性结直肠癌在结直肠癌体系中占重要比例，其具有遗传性、高发性、多发性和肿瘤发生的多器官性等特征，临床上依据有无多发性息肉病，将遗传性结直肠癌分为遗传性息肉病和遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)两大类，两类遗传性结直肠癌皆为常染色体显性遗传。据报道，遗传性非息肉病性结直肠癌约占结直肠癌的15％左右。结直肠癌从发生机制上分为染色体不稳定和微卫星不稳定两种类型。微卫星是遍布人类基因组中的短串联重复序列。微卫星不稳定(MicrosatelliteInstability，MSI)是指由于缺失或插入重复单位引起肿瘤的DNA与同一个体的正常胚系DNA相比微卫星长度发生改变，即产生异常长度的等位基因。研究表明，15％结直肠癌是经MSI途径发生，MSI是由于错配修复基因发生缺陷引起，而遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)是由错配修复基因胚系突变所致的显性遗传病，90％以上的典型HNPCC患者具有MSI特征。另外，也有15％左右的散发性结直肠癌患者具有MSI特征。MSI的HNPCC发生的主要原因是生殖细胞的错配修复(mismatchrepair，MMR)基因突变。hMLHl，hMSH2，hMSH6和hPMS2等任何一个或几个错配修复基因的失活都能导致MSI发生，散发结直肠癌病人多数仅有错配修复基因体细胞突变。1997年，MSI国际研究合作组织在针对肿瘤的微卫星不稳定及复制错误表型检测的国际会议制定了统一的MSI检测标准，即BethesdaGuidelines。该标准明确MSI检测的参考检测位点，包括两个单核苷酸重复单元的微卫星位点(BAT-25和BAT-26)和三个二核苷酸重复单元的微卫星位点(D2S123，D5S346和D17S250)。应用本标准检测肿瘤样本的MSI状态时，5个微卫星位点如果检测出2个或者2个以上的位点发生改变，则被称为MSI-H型，即高频度微卫星不稳定，MSI-H型肿瘤表选出特有的临床及病理学表型。5个微卫星位点如果只检测出一个位点发生改变，则被称为MSI-L型，即低频度微卫星不稳定。5个微卫星位点都没有发生改变，则被称为MSS型，即微卫星稳定型。通常，由于MSI-L型和MSS型的临床表现无明显差别，所以将MSI-L型划入MSS型。MSI结直肠癌与MSS结直肠癌相比，在预后和治疗等方面具有显著的差异，MSI结直肠癌检测临床意义包括预后性，预测性和HNPCC的辅助诊断和筛查三个方面。MSI-HII期结直肠癌5年无复发生存率高于MSSII期结直肠癌。即在II期结直肠癌患者中，MSI-H状态提示良好预后。5-氟尿嘧啶是结直肠癌术后辅助治疗的重要化疗药物。MSH-HII期结直肠癌患者有良好的预后但不能从5-氟尿嘧啶治疗中获益。从MSI-H结直肠癌中筛选出来的患者，就个人而言早期诊断和预防性息肉切除术可以降低CRC死亡率。此外，还可以为患者家族成员提供肿瘤预防和筛查。所以临床上已将MSI作为结直肠癌预后和制定辅助治疗方案的重要分子标记物，并协助HNPCC的筛选。在2011年关于结直肠癌筛查的NationalComprehensiveCancerNetwork指南中，已经将MSI检测列入必要检测项目。2017年5月，美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)破天荒宣布“加速批准PD-1抗体用于确定有高频度微卫星不稳定或者错配修复基因缺陷的成人和儿童晚期或者转移性实体肿瘤患者”。FDA批文中明确规定只有高频度微卫星不稳定或错配修复基因缺陷的患者才能有较高的概率从PD-1(programmeddeath1)抗体中获益，权威数据表明在用PD-1抗体治疗前，先要做MSI检测，因为只有MSI-H型病人，接受PD-1抗体治疗，有效率才比较高，MSS型病人，有效率很低甚至极低。传统的基于PCR技术的MSI检测技术通常有两种，一种是通过对待检微卫星位点上下游的序列进行PCR扩增，扩增产物聚丙烯酰氨凝胶电泳，然后经过各种显示系统(放射自显影、银染等)分析有无迁移率的变化；另外一种技术为直接测序法，即对PCR扩增产物直接Sanger测序来检测微卫星位点是否发生重复单元的插入或者缺失。但是上述两种检测技术都各有缺陷。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术存在操作繁琐，耗时长，通量低和灵敏度低等很多缺陷。直接测序法存在价格昂贵，所需实验条件较高，而且通量不高等缺陷。另外，基因组中待检微卫星位点的序列拷贝数低，很难直接被检测。另外，待检的五个微卫星位点都是单核苷酸重复单元，微卫星长度的变化比较小，微卫星长度变化基本小于10bp，而传统的基于PCR方法的MSI检测方法灵敏度和准确性都比较低，而且完成五个位点检测需要进行多个PCR反应和后续对应的实验流程才能完成一个样本的检测。另外，现有肿瘤结直肠癌微卫星不稳定检测中，较少检测内参微卫星位点，缺乏阳性参照，致使部分检测结果的可信度降低。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其可针对内参微卫星位点检测，以指示待检样品是否被污染，提高检测结果的可信度。本专利技术的另一目的在于提供一种结直肠癌微卫星不稳定检测的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供上述核酸组合的应用。本专利技术的再一目的在于提供结直肠癌微卫星不稳定检测的方法。本专利技术是这样实现的：一种用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其包括：针对内参微卫星位点扩增的内参引物；内参微卫星位点选自PentaC和PentaD中的至少一种。一种结直肠癌微卫星不稳定检测的试剂盒，其包括上述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合。上述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合在结直肠癌微卫星不稳定检测中的应用。一种结直肠癌微卫星不稳定检测的方法，其包括：采用上述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合对待检样品进行PCR扩增。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的提供的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其包括针对选自PentaC和PentaD中的至少一种的内参微卫星位点扩增的内参引物，其可针对内参微卫星位点检测，将具有五核苷酸重复单元的PentaC和PentaD内参位点作为阳性质控，以指示待检样品是否被污染，提高检测结果的可信度。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例5中的采用实施例1提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合和Promega对照试剂盒检测S1样本的峰型图谱；图2为本专利技术实施例5中的采用实施例1提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，其包括：针对内参微卫星位点扩增的内参引物；所述内参微卫星位点选自Penta C和Penta D中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，其包括：针对内参微卫星位点扩增的内参引物；所述内参微卫星位点选自PentaC和PentaD中的至少一种。2.根据权利要求1所述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述内参引物包括：SEQIDNO.1-2所示的第一引物对和SEQIDNO.3-4所示的第二引物对中的至少一种引物对。3.根据权利要求2所述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括：针对待检微卫星位点扩增的检测引物；所述待检微卫星位点选自BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24和MONO-27中的至少一种。4.根据权利要求3所述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述检测引物包括：SEQIDNO.5-6所示的第三引物对、SEQIDNO.7-8所示的第四引物对、SEQIDNO.9-10所示的第五引物对、SEQIDNO.11-12所示的第六引物对和SEQIDNO.13-14所示的第七引物对中的至少一种引物对。5.根据权利要求4所述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述第一引物对、所述第四引物对以及所述第五引物对均标记有第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云静，李威，张中娜，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31