检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组，包括针对CaATL1、CaMV35S、NPT II基因的三重引物组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重引物组B，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.12所示。本发明专利技术属于基因工程检测技术领域，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对辣椒转基因成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，适于辣椒产品的转基因成分检测。

Three heavy fluorescent PCR primer group, probe group, kit and method for detecting the transgenic components of chili pepper

The present invention discloses three fluorescence PCR primer set pepper GMO detection, including three primer set A for CaATL1, CaMV35S, NPT and II gene for NOS, CMV, TMV gene of three B specific primer set, such as Seq.ID No.1 Seq.ID No.12 to shown. The invention belongs to the technical field of detection of gene engineering, the primers and probes do not cause interference, only on specific target sequences were amplified and the fluorescence signal, no amplification and fluorescence signal of non target sequences can achieve accurate detection of transgenic pepper, has the advantages of good specificity, standard error, short detection time, saving the cost of reagents, detection of GMOs for chili products.

【技术实现步骤摘要】
检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法
本专利技术属于基因工程检测
，尤其涉及检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组、探针组、试剂盒及方法。
技术介绍
民以食为天，食品安全是社会和谐的基础支柱之一。1983年，世界上首例转基因作物(烟草)在美国研发成功；1994年，美国Monsanto公司的延熟保鲜转基因西红柿在美国批准上市。目前，转基因作物的品种和产量正在迅速增长：欧盟基本禁止了转基因作物的种植，但进口、加工、销售较多，如玉米、油菜、大豆、甜菜均在市场流通和食用；美国大量种植、生产和销售大豆、玉米、棉花、马铃薯等多种转基因作物。我国农业部批准发放了7种转基因作物安全证书，分别是耐储存番茄、抗虫棉花、改变花色矮牵牛、抗病辣椒、抗病番木瓜、转植酸酶玉米、抗虫水稻，每种转基因作物均包含若干具体获证品系，并允许种植、生产、加工、销售。转基因作为一种新兴的生物技术手段，科研界大多持肯定态度，而民间大多持观望或否定态度；虽然相关争论在近年内难见分晓，但世界大多数国家，包括我国，均已通过法律法规的形式，要求其产品或食品上应具有明晰的转基因标识，确保消费者的知情权和选择权。目前，PCR技术是检测和鉴定转基因产品的主流方法，通过在样品DNA中检测某外源基因，从而判定样品是否含有该转基因成分。样品中DNA的提取，从操作方式可分为自动化提取，如尚未普及的自检工作站；半自动化提取，如已逐渐普及的核酸提取仪；手动提取，如当前常见的商品化试剂盒、自制试剂等。原料和粗加工品的样品，DNA损失小且较完整，上述三种方法均可适用，通常DNA纯度OD260/OD280为1.6至1.8，浓度在ng/μL级，可略作稀释或直接用于PCR检测。深加工的样品，DNA损失大且碎片化，自动化、半自动化、商品化试剂盒等模式方法得率较低已不适用；通常采用手动提取中自制试剂的方法。因为样品种类、研究方式区别很大，自制试剂的方法也种类广泛、差异显著，效果也参差不齐。第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。涉及转基因成分检测的PCR技术，已有较广泛的报道，但多为普通PCR方法。多重荧光PCR方法在转基因成分检测方面的应用较少，涉及转基因大豆和转基因番茄等，具体包括：中国专利申请201410843991.X《转基因大豆GTS40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量PCR检测引物组和方法》、中国专利申请201310248783.0《利用四重荧光定量PCR检测番茄转基因成分的方法》、中国专利申请201410033119.9《一种肉制品中植物源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法和检测试剂盒》等。现有技术并未报道检测辣椒转基因成分的多重荧光PCR方法，已报道的大豆转基因和番茄转基因的检测等，与辣椒转基因成分的检测在核心引物和探针序列及荧光标记等方面存在显著的差异。因此，提供一种检测辣椒转基因成分的多重荧光PCR方法具有重要意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术将辣椒转基因品系的内源和特定外源基因(包括转基因通用元件和外源功能基因)同时用于设计特异性的引物组和探针组，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对辣椒转基因成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，有利于不同品系辣椒转基因成分的充分检出。此外，通过设置三重引物组A和三重引物组B，在三重引物组A中CaATL1基因扩增检测结果为阴性的情况下，可避免三重引物组B的扩增，节约试剂和检测时间。本专利技术选定的具体内源和外源基因包括：①内源基因CaATL1：英文全称CapsicumannuumL.BukangAT-hook-likegene1，中文名编码辣椒AT-hook1蛋白基因。②外源基因CaMV35S：英文全称35promoterformcauliflomermosaicvirus，中文名花椰菜花叶病毒35S启动子。③外源基因NPTII：英文全称NeomycinphosphotransferaseII，中文名新霉素-3’-磷酸转移酶。④外源基因NOS：英文全称Nopalinesynthaseterminator，中文名胭脂碱合成酶3’转录终止子。⑤外源基因CMV：英文全称Cucumbermosaicvirus，中文名黄瓜花叶病毒。⑥外源基因TMV：英文全称Tobaccomosaicvirus，中文名烟草花叶病毒。本专利技术的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。本专利技术提供检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物及探针组如表1和表2，包括针对CaATL1、CaMV35S、NPTII基因的三重引物及探针组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重引物及探针组B。表1检测基因的引物及探针组表2探针修饰基团进一步地，本专利技术提供检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR试剂盒，包括权利要求1所述的PCR引物组、权利要求2所述的PCR探针组、荧光PCR试剂、阳性对照和阴性对照。所述荧光PCR试剂为常规市售产品，如Path-IDTMqPCRMasterMix、TaqManTMEnvironmentalMasterMix2.0、MultiplexPCRKit、TaKaRaPremixExTaqTM(ProbeqPCR)等常见荧光PCR试剂。采用本专利技术提供的三重荧光PCR试剂盒，可进行方便快捷地检测。优选地，所述阳性对照为用所述的引物组进行扩增，并用所述的探针组检测的混合DNA片段或基因组，浓度为105copies/μL级。优选地，所述阴性对照为非转基因源性且非辣椒源性DNA。还可以进一步包括空白对照，空白对照为三蒸水。优选地，所述CaATL1、CaMV35S、NPTII、NOS、CMV和TMV基因的上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μmol/L。此外，本专利技术还提供检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR方法，包括如下步骤：S1进行样品处理，提取样品DNA；S2建立包括权利要求1所述的PCR引物组和权利要求2所述的PCR探针组的三重荧光PCR反应体系，反应条件为：95℃20-120s或10-15min；95℃5-60s，60℃20-120s，本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组，其特征在于：包括针对CaATL1、CaMV35S、NPT II基因的三重引物组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重引物组B；CaATL1基因的上游引物为Seq.ID No.1，下游引物为Seq.ID No.2；CaMV35S基因的上游引物为Seq.ID No.3，下游引物为Seq.ID No.4；NPT II基因的上游引物为Seq.ID No.5，下游引物为Seq.ID No.6；NOS基因的上游引物为Seq.ID No.7，下游引物为Seq.ID No.8；CMV基因的上游引物为Seq.ID No.9，下游引物为Seq.ID No.10；TMV基因的上游引物为Seq.ID No.11，下游引物为Seq.ID No.12。

【技术特征摘要】
1.检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR引物组，其特征在于：包括针对CaATL1、CaMV35S、NPTII基因的三重引物组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重引物组B；CaATL1基因的上游引物为Seq.IDNo.1，下游引物为Seq.IDNo.2；CaMV35S基因的上游引物为Seq.IDNo.3，下游引物为Seq.IDNo.4；NPTII基因的上游引物为Seq.IDNo.5，下游引物为Seq.IDNo.6；NOS基因的上游引物为Seq.IDNo.7，下游引物为Seq.IDNo.8；CMV基因的上游引物为Seq.IDNo.9，下游引物为Seq.IDNo.10；TMV基因的上游引物为Seq.IDNo.11，下游引物为Seq.IDNo.12。2.检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR探针组，其特征在于：包括针对CaATL1、CaMV35S、NPTII基因的三重探针组A和针对NOS、CMV、TMV基因的三重探针组B；CaATL1基因的探针为Seq.IDNo.13，5’端用FAM荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；CaMV35S基因的探针为Seq.IDNo.14，5’端用HEX荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；NPTII基因的探针为Seq.IDNo.15，5’端用TAMRA荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；NOS基因的探针为Seq.IDNo.16，5’端用FAM荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；CMV基因的探针为Seq.IDNo.17，5’端用HEX荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰；TMV基因的探针为Seq.IDNo.18，5’端用TAMRA荧光激发基团修饰，3’端用MGB荧光淬灭基团修饰。3.检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的PCR引物组、权利要求2所述的PCR探针组、荧光PCR试剂、阳性对照和阴性对照。4.根据权利要求3所述的检测辣椒转基因成分的三重荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为用权利要求1所述的引物组进行扩增，并用权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙端方，罗绍楠，戴奕杰，董睿，李春宇，田志强，刘廷菊，陈梅，
申请(专利权)人：贵州省产品质量监督检验院，
类型：发明
国别省市：贵州,52