适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法及其应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体公开了一种适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法及其应用。本发明专利技术提供的适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法包括如下步骤：（1）对样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化；（2）对步骤（1）中转化后的基因组DNA进行线性扩增；（3）对步骤（2）中线性扩增的扩增子进行指数扩增，所述指数扩增的扩增子用作测序文库。所述文库建立方法的样本基因组DNA起始量可低至pg级，采用所述方法建立的文库进行测序，可对全基因组的绝大多数胞嘧啶进行检测，可以覆盖到全基因组的绝大多数区域。

Method and application of Library Establishment for single cell genome sequencing

The invention relates to the field of molecular biology technology, and specifically discloses a method for establishing library for single cell genome sequencing and its application. The invention provides a library suitable for single cell genome methylation sequencing method comprises the following steps: (1) the genomic DNA samples of bisulfite conversion; (2) to step (1) genomic DNA transformed by linear amplification; (3) to step (2) amplicon in linear amplification the exponential amplification, the exponential amplification of the amplicon sequencing library used. The initial genomic DNA of the library establishment method can be as low as PG, and the library constructed by the method can be sequenced, which can detect the majority of cytosine in the whole genome and cover all the whole genome.

【技术实现步骤摘要】
适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法及其应用。
技术介绍
以甲基化修饰为代表的DNA的表观修饰一直以来都是研究热点。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。研究表明甲基化修饰与癌症发生、早期胚胎发育等生理过程密切相关。现有技术中基因组甲基化测序方法如表1所示：表1表1中的甲基化测序方法可以概括为三大类：重亚硫酸盐测序；基于限制性内切酶的测序；靶向富集甲基化位点测序。基于这三大类方法方法衍生出了如BS-seq、RRBS-seq、MeDIP-seq等具体的实验方案。现有的方案存在的缺点有，需要大量的起始样本(纳克甚至微克级)，需要以组织或细胞团为起始材料，样本来源具有一定程度局限性；多针对CpG岛进行研究，CpG岛是富含CpG二核苷酸序列的区域，在成本有限的情况下是一种性价比高的研究手段。但是CpG岛的信息量只占所有CpG位点的约10％的数据量，会丢失绝大部分的有用信息。并且现有的实验方案如RRBS-seq、MeDI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化；(2)对步骤(1)中转化后的基因组DNA进行线性扩增；(3)对步骤(2)中线性扩增的扩增子进行指数扩增，所述指数扩增的扩增子用作测序文库。

【技术特征摘要】
1.一种适用于单细胞基因组甲基化测序的文库建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对样本的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化；(2)对步骤(1)中转化后的基因组DNA进行线性扩增；(3)对步骤(2)中线性扩增的扩增子进行指数扩增，所述指数扩增的扩增子用作测序文库。2.根据权利要求所述的文库建立方法，其特征在于，所述样本基因组DNA由单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得。3.根据权利要求1所述的文库建立方法，其特征在于，步骤(2)中，所述线性扩增的引物为随机引物对。4.根据权利要求3所述的文库建立方法，其特征在于，所述随机引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的结构为：5’-测序平台匹配引物序列-随机序列-3’，所述第二引物的序列为5’-测序平台匹配引物序列-随机序列-3’；或者，所述第一引物的结构为5’-测序平台匹配引物序列-随机序列-三联重复序列-3’，所述第二引物的结构均为：5’-测序平台匹配引物序列-随机序列-三联重复序列-3’；或者，所述第一引物的结构为5’-测序平台匹配引物序列-分子标签序列-随机序列-3’，所述第二引物的结构均为：5’-测序平台匹配引物序列-分子标签序列-随机序列-3’；或者，所述第一引物的结构为5’-测序平台匹配引物序列-分子标签序列-随机序列-三联重复序列-3’，所述第二引物的结构均为：5’-测序平台匹配引物序列-分子标签序列-随机序列-三联重复序列-3’。5.根据权利要求4所述的文库建立方法，其特征在于，所述第一引物中的测序平台匹配引物序列如SEQIDNO.1所示，具体为：ACACGACGCTCTTCCGATCT；所述第二引物中测序平台匹配引物序列如SEQIDNO.2所示，具体为：CTGAACCGCTCTTCCGATC。6.根据权利要求4所述的文库建立方法，其特征在于，所述第一引物中的随机序列的长度为4～20nt，所述第二引物中的随机序列的长度为4～20nt。7.根据权利要求4所述的文库建立方法，其特征在于，所述第一引物中的三联重复序列记为XXX，所述第二引物中的三联重复序列记为YYY，则XXX为TTT、YYY为GGG；XXX为AAA、YYY为GGG；XXX为TTT、YYY为CCC；或者XXX为AAA、YYY为CCC；所述分子标签序列为确定的序列或随机序列，优选的为2-20nt的随机序列，更优选的为4-10nt的随机序列，更优选的为6-8nt的随机序列。8.根据权利要求1所述的文库建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述线性扩增的DNA聚合酶为具有链置换活性的酶；其中，所述链置换活性的酶选自但不限于klenow片段(3′→5′exo-)、klenow片段、bstDNA聚合酶、ventDNA聚合酶(3′→5′exo-)、ventDNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、deepventDNA聚合酶(3′→5′exo-)、deepventDNA聚合酶中的任一种或多种。9.根据权利要求1所述的文库建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述指数扩增的引物包括第三引物和第四引物；所述第三引物的序列如SEQIDNO：3所示，具体为：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；所述第四引物的序列如SEQIDNO：4所示，具体为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC-3’，其中，NNNNNN为索引index序列。10.如权利要求1-9任一项所述文库建立方法用于单细胞样本或多细胞样本的基因组DNA甲基化测序及甲基化位点分析中的用途。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，李静，陈昌岳，张祥林，胡秋萍，任一，路远，黄克非，闫丽，
申请(专利权)人：上海美吉医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31