用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3和环引物LB。采用该引物组用于检测饲料中的大肠杆菌O157，其步骤包括大肠杆菌O157培养、DNA提取、环介导等温扩增反应、结果观察。试验证明，本发明专利技术引物组对产气肠杆菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌无特异性表达，针对大肠杆菌O157有明显表达，特异性高；采用本发明专利技术环介导等温扩增检测方法检测饲料，检测结果非常精确，对饲料中大肠杆菌O157检出限为2CFU/25g。此外，采用本发明专利技术检测饲料还具有检测速度快、操作方便等优势。

Primer group and detection method for detection of Escherichia coli O157 in feed

The invention provides a primer group for detecting Escherichia coli O157 in feeds, including internal primers FIP, primers BIP, outer primers F3, outer primers B3 and ring primer LB. The primer group was used to detect Escherichia coli O157 in feed. The steps included O157 culture, DNA extraction, loop mediated isothermal amplification and result observation. Experiments show that the invention group of primers on the expression of Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Salmonella Enteritidis is nonspecific for Escherichia coli O157 was expressed, high specificity; the loop mediated isothermal amplification detection by feed detection method, detection results are very accurate, to feed in Escherichia coli O157. The limit is 2CFU/25g. In addition, the invention also has the advantages of fast detection speed, convenient operation, and so on.

【技术实现步骤摘要】
用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组及其检测方法
本专利技术涉及一种肠细菌的检测方法，具体是基于环介导等温扩增技术的用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组及其检测方法。
技术介绍
大肠杆菌O157，埃希氏菌属，革兰氏染色阴性，动力试验呈阳性。大肠杆菌O157是一种可引起人、动物肠道出血性腹泻、肠炎等症状的肠细菌，又称之为肠出血性大肠杆菌，以O157:H7血清型为代表菌株。大肠杆菌O157一般通过饮水、食物、排泄物、密切接触等途径传播疾病，病情严重者，可危及生命，食品卫生主管部门已将大肠杆菌O157列为常规检测项目。目前，大肠杆菌O157的检测方法包括常规法(细菌培养、分离、鉴定)、金标试纸法、单克隆酶联免疫分析筛选方法、动酶联荧光免疫检测系统(VIDAS)筛选法、显色培养基法、DNA探针技术、PCR法/荧光PCR法。其中，常规法检测存在耗时长，培养基、操作步骤或培养条件在不同实验室差别较大等缺点，检测结果可能不一致或出现假阴/阳性；PCR法/荧光PCR法，操作过程复杂，且对样品、仪器设备、实验室条件以及实验人员的技术要求高，检测成本高，难以在基层推广应用。基于此，日本学者Notomi在NucleicAcidsRes杂志(2000年)上公开了一种新的基因诊断技术—环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification)，用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测，食品、化妆品的安全检查与诊断。环介导等温扩增技术具有高特异性、高灵敏度等优点，操作过程简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，检测结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。目前，有文献报道采用环介导等温扩增技术检测大肠杆菌O157:H7，但是检测灵敏度不高，相较于普通PCR没有体现环介导等温扩增技术灵敏度方面显著的优越性。例如，CN106676173A公开的一种检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测方法，先提取待测样品DNA；然后配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物内引物对FIP和BIP和外引物对F3和B3(SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4)；再以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。采用该方法对EHECO157:H7定性检测灵敏度为3.45×104CFU/mL，仅仅略优于一般PCR检测方法。因此，有必要基于环介导等温扩增技术开发一种检测大肠杆菌O157的新方法。此外，本领域技术人员知晓，利用环介导等温扩增技术检测病菌，其特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应。而引物序列直接影响检测灵敏度和检测结果，引物设计属于一大技术难点，引物设计不合理，甚至可能会导致基因不适于环介导等温扩增方法。另外，引物设计需要考虑Tm值、引物末端的稳定性、GC含量、二级结构以及引物之间的距离，现有环介导等温扩增试验，为防止GC含量直接影响DNA的结合度和扩增效果，GC含量通常为50-60％，且F2/B2、F3/B3、LF/LB的3’末端和F1c/B1c的5’末端作为DNA合成的起点必需有一定的稳定性，自由能应该≤-4kcal/mol。本领域技术人员还知晓，检测灵敏度是衡量检测方法和仪器的重要指标，而现有环介导等温扩增技术的灵敏度检出限为100CFU/mL，要在此基础上将检测灵敏度进一步提高存在非常多的技术难点。即便如此，专利技术人依然尝试设计新的引物组，以尽可能提高检测灵敏度。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是基于环介导等温扩增技术，提供一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，本专利技术的另一目的是利用该引物组检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法，以解决现有环介导等温扩增技术在检测饲料中大肠杆菌O157过程中存在的灵敏度低的技术问题。本专利技术采用大肠杆菌O157：H7的特异基因rfbE作为靶基因，针对rfbE基因的保守区设计4-5条特定的环介导等温扩增引物，结合大肠杆菌O157：H7的基因组DNA，建立特定的环介导等温扩增引物的检测反应体系，并根据荧光染料显色情况进行结果判断,从而显著的提高了检测饲料中大肠杆菌O157的灵敏度。除特殊说明外，本专利技术所述试剂、菌株均为本领域普通技术人员知晓的市售产品，所述百分比为质量百分比，所述试验方法均为常规实验方法，本领域技术人员根据本专利技术记载的内容能够直接实现本专利技术目的。本专利技术的目的是这样实现的：一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3，具体引物基因序列如下：上述引物组稳定性、特异性、扩增性能好，综合性能优异，将其用于检测饲料中大肠杆菌O157，检测灵敏度非常高，检出限可达到4CFU/25g。为进一步提高本专利技术检测方法的扩增效率、特异性和灵敏度，上述用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组好包括环引物LB；优选地，上述用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组是由内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3和环引物LB组成，具体引物基因序列如下：基于环介导等温扩增技术，采用上述引物组用于检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法，包括大肠杆菌O157培养、DNA提取、环介导等温扩增反应、结果观察步骤，具体为：步骤1，大肠杆菌O157培养：对确证无大肠杆菌O157的配合饲料，人工引入大肠杆菌O157，加入肉汤后置于无菌恒温环境中培养，得到增菌液；步骤2，DNA提取：先将前述所得增菌液离心处理后去掉上清液，然后用重蒸水洗涤、沉淀得到菌悬液，再将所得菌悬液煮沸后进行离心处理，去掉上清液，得到模板DNA；步骤3，环介导等温扩增反应：将包含反应液、聚合酶、引物组和模板DNA的反应体系加入PCR管中，同时将显色液加在PCR管盖中间，并置于水浴锅或金属浴中反应30-60min；步骤4，结果观察。根据本专利技术的一个优选实施方案，通过特定浓度的引物组来进一步提高检测灵敏度，上述引物组中内引物(FIP)浓度为1.5-2μL，内引物(BIP)浓度为1.5-2μL，外引物(F3)浓度为0.2-0.25μL，外引物(B3)浓度为0.2-0.25μL。根据本专利技术的另一个更优选实施方案，通过特定浓度的反应体系来更进一步提高检测灵敏度，上述环介导等温扩增反应为：在PCR管中加入反应液RM(2×)12.5μL、内引物(FIP)1.5-2μL、内引物(BIP)1.5-2μL、外引物(F3)0.2-0.25μL、外引物(B3)0.2-0.25μL、环引物(LB)0.8-1μL、Bst聚合酶0.8-1μL、模板DNA1-2μL，重蒸水补足25μL，混匀后得到反应体系，然后加入密封液20μl，同时将0.8-1μL显色液加在PCR管盖中间，并置于水浴锅或金属浴中反应30-60min；本专利技术具如下有益效果：针对靶基因GC含量较低，容易出现非特异扩增的特点，本专利技术在设计环介导等温扩增引物时统筹兼顾引物末端稳定性，引物Tm值，二级结构、引物位置等影响引物质量的因素，使引物组的综合性能最优。本专利技术采用4-5条特定的环介导等温扩增引物，结合大肠杆菌O157的基因组DNA，建立特定的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3，其特征在于：所述内引物FIP的基因序列为SEQ ID NO.1，所述内引物BIP的基因序列为SEQ ID NO.2，所述外引物F3的基因序列为SEQ ID NO.3，所述外引物B3的基因序列为SEQ ID NO.4。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，包括内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3，其特征在于：所述内引物FIP的基因序列为SEQIDNO.1，所述内引物BIP的基因序列为SEQIDNO.2，所述外引物F3的基因序列为SEQIDNO.3，所述外引物B3的基因序列为SEQIDNO.4。2.根据权利要求1所述的用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，其特征在于：所述引物组中还包括环引物LB。3.根据权利要求1所述的用于检测饲料中大肠杆菌O157的引物组，其特征在于：所述引物组由所述内引物FIP、所述内引物BIP、所述外引物F3、所述外引物B3和环引物LB组成，且所述环引物LB的基因序列为SEQIDNO.5。4.如权利要求1-3任一项所述的引物组用于检测饲料中大肠杆菌O157的检测方法，其特征在于具体步骤如下：步骤1，大肠杆菌O157培养：对确证无大肠杆菌O157的配合饲料，人工引入大肠杆菌O157，加入肉汤后置于无菌恒温环境中培养，得到增菌液；步骤2，DNA提取：先将前述所得增菌液离心处理后去掉上清液，然后用重蒸水洗涤、沉淀得到菌悬液，再将所得菌悬液煮沸后进行离心处理，去掉上清液，得到模板DNA；步骤3，环介导等温扩增反应：将包含反应液、聚合酶、引...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡健，范首君，何义刚，丁平，蔺露，张毅，欧阳吴莉，
申请(专利权)人：重庆市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：重庆,50