一种靶向猪伪狂犬病毒gD蛋白的纳米抗体、制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种特异性靶向PRV的纳米抗体PRV

【技术实现步骤摘要】
一种靶向猪伪狂犬病毒gD蛋白的纳米抗体、制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种靶向猪伪狂犬病毒(Porcine Pseudoraibies Virus，PRV)gD蛋白的纳米抗体、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪伪狂犬病(Porcine Pseudoraibies，PR)是猪的一种急性传染病，又称Aujeszky病，由猪伪狂犬病毒(Porcine Pseudoraibies Virus，PRV)引起。猪作为PRV的天然宿主，对病毒感染更为敏感，是可在急性感染中存活并具有潜伏感染力的唯一动物物种。感染后新生仔猪以高死亡率与神经系统紊乱为特征，怀孕母猪出现流产与繁殖障碍，老年猪以呼吸道疾病为主，以神经症状为特征的仔猪死亡率大于20％，猪感染野生型病毒的几率高达50％，使我国养猪业损失巨大。
[0003]PRV目前已知的只有一种血清型，为线性双链的DNA病毒，约145KDa大小，GC的含量平均为73.59％。PRV共编码70多种蛋白，主要蛋白除gG蛋白外，其余10个(gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK、gL、gM、gN)均为囊膜结构蛋白。其中糖蛋白B(gB)，糖蛋白C(gC)，糖蛋白D(gD)与糖蛋白H(gH)在易感动物中，诱导其保护性免疫应答，产生具有中和作用的抗体与抗病毒性的细胞免疫，为主要的具有保护性的抗原。
[0004]从敏感性与特异性上来说，病毒的分离与鉴定是检测PRV的黄金标准，但该分耗时长(至少2
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3天)，且灵敏度较低，且需要较高的细胞培养水平，病毒培养过程也易出现细节性操作失误而最终影响诊断结果，因此很难在基层兽医单位得到推广。病毒中和试验(VNT)为PRV检测中常用的方法之一，此方法高效且敏感。但是，在感染的急性阶段此方法敏感性低，而且容易使结果呈现假阴性。间接夹心ELISA等免疫学诊断方法虽然具有很高的灵敏性和很强的特异性，但需要较多纯度的蛋白，且需要精细操作且易出现假阳性，尤其依赖敏感性和特异性高的检测抗体，可以说检测抗体的性质就直接决定了检测的准确性和精度。
[0005]单克隆抗体(mAb)自问世以来，在医学诊断、制药、治疗与科学研究等领域得到了广泛的应用。而近些年发现的纳米抗体不仅实现了与传统抗体相当的特异性结合力，作为新一代抗体衍生物其具有诸多传统抗体没有的优势。因此，近来纳米抗体被认为是高价值的蛋白，并被应用于包括基础研究、诊断、治疗、食品科学等多个领域中。但是目前关于纳米抗体在PRV诊断方法中的应用却未见相关研究报道，也未有商品化产品。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术中的不足，本专利技术的目的是提供一种靶向猪伪狂犬病毒gD蛋白的纳米抗体、制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gD蛋白，将其命名为PRV
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DND，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0008]进一步的，本专利技术还提供一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码上述纳米抗体
PRV
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DND的氨基酸序列。
[0009]进一步的，本专利技术还提供一种含有所述纳米抗体PRV
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DND的表达盒、载体、宿主细胞、表达系统。
[0010]进一步的，所述的含有所述纳米抗体PRV
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DND的表达盒、载体、宿主细胞、表达系统中包含可以编码PRV
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DND的核苷酸序列。
[0011]进一步的，本专利技术提供一种纳米抗体PRV
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DND的制备方法，包括以下步骤：
[0012](1)重组真核表达载体的构建：通过PCR扩增、酶切，将编码纳米抗体PRV
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DND的DNA序列连接至表达载体中获得阳性质粒；
[0013](2)将步骤(1)中阳性质粒转化宿主细胞，诱导表达纳米抗体PRV
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DND。
[0014]进一步的，所述表达载体可以为真核表达载体或原核表达载体，优选的，所述表达载体为真核表达载体，所述表达载体可选自：pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pB SII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET 15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP
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N1(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR
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α(PCT Pub.No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco
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BRL，Grand Island，NY)等。
[0015]所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母或真核细胞，优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可选自例如：中国仓鼠的卵巢细胞CHO、猴的肾脏细胞COS细胞、人的胚肾细胞HEK
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293、人的子宫颈癌细胞HELA等。
[0016]进一步的，本专利技术提供一种纳米抗体PRV
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DND与多种标记酶(如辣根过氧化物酶、生物素等)进行偶联形成的融合蛋白。优选的，所述标记酶为HRP，所述融合蛋白为PRV
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DND
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HRP。
[0017]进一步的，本专利技术还提供一种所述的纳米抗体PRV
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DND在制备检测样品中PRV抗体的产品中的应用。
[0018]优选的，所述的应用为竞争性ELISA检测，所述竞争性ELISA包括以下步骤：
[0019](1)将PRV的gD蛋白包被ELISA板；
[0020](2)将所述融合蛋白PRV
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DND
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HRP与样品混合后加入步骤(1)的ELISA板中，孵育；
[0021](3)在步骤(2)的ELISA板中加入显色液避光显色，加入3M浓H2SO4终止反应；
[0022](4)观察ELISA板的颜色变化，若样品中有PRV抗体，则ELISA板内孔为无色；若样品中无PRV抗体，则ELISA板内孔为黄色。
[0023]进一步的，本专利技术还提供PRV检测试剂盒，所述试剂盒中含有所述的纳米抗体PRV
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DND或者融合蛋白PRV
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DND
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HRP。
[0024]有益效果
[0025]本专利技术提供了一种特异性靶向PRV的纳米抗体PRV
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DND，并公开了所述纳米抗体的氨基酸序列。同时提供了所述纳米抗体PRV
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DND或融合蛋白PRV
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DND
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HRP的制备方法。尤其是利用耦合的标记酶形成的融合蛋白作为竞争探针，提供了一种检测样本中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gD蛋白，将其命名为PRV
‑
DND，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。2.一种编码权利要求1所述纳米抗体氨基酸序列的核苷酸分子。3.一种含有权利要求1所述的纳米抗体与HRP的融合蛋白。4.一种含有权利要求1所述的纳米抗体的表达盒、载体、宿主细胞、表达系统。5.一种权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的融合蛋白、或权利要求4所述的表达盒、载体、宿主细胞、表达系统在制备检测样品中猪伪狂犬病毒抗体的产品中的应用。6.根据权利要求5所述的融合蛋白在制备检测样品中猪伪狂犬病毒抗体的产品中的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：董春霞，曾政，费磊，骆璐，胡健，孙燕，蒋佳利，贺青松，王萍，钟莉，
申请(专利权)人：重庆市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：