一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用。分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F3H，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021286，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年10月20日。其中，特异性结合减蛋综合征病毒的抗体或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示。本发明专利技术的单克隆抗体6H3F可用于免疫胶体金检测试纸条，该试纸条具有较好的特异性和灵敏度，试验表明病毒检测限为0.01ng/mL。表明病毒检测限为0.01ng/mL。表明病毒检测限为0.01ng/mL。

【技术实现步骤摘要】
一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]减蛋综合症(Egg Drop Syndrome，EDS
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76)是由减蛋综合症病毒(Egg Drop Syndrome Virus，EDSV)引起的，以产软壳、薄壳、无壳蛋，产蛋率严重下降为主要特征的传染病。在1976年荷兰科学家Van Eck首次发现以来，EDSV已经成为世界范围内影响鸡产蛋的主要病因之一。目前研究发现，作为影响家禽业的重要疾病，EDSV在雏鸭中能诱发急性呼吸道疾病，具有潜在致病性，带来严重的经济损失。
[0003]减蛋综合症病毒属于禽腺病毒Ⅲ群，血清型单一，菌株之间几乎不存在抗原性差异，病毒基因组为约33kb的线状双股DNA，病毒颗粒由结构蛋白组成，核衣壳直径70～80nm，呈二十面体对称，DNA被包于衣壳内。该结构蛋白包括核心蛋白(Core Protein)、构成衣壳的六邻体(Hexon蛋白)、以纤维状突起从衣壳突出的三聚体纤维突出(Fiber蛋白)及作为其基部的五邻体(Penton蛋白)等。其中，六邻体、三聚体纤维及五邻体基座存在中和表位，其中的Fiber蛋白与入侵宿主细胞有关。Fiber蛋白是制备EDS疫苗的理想抗原，能够刺激机体产生强的B细胞免疫应答，也是制备EDSV抗体的理想免疫原。
[0004]由于EDS主要引起产蛋性能下降，发病特征不明显，感染鉴别在EDSV防控中显示出非常重要的作用，因此，针对现有EDS防控技术中的问题，本专利技术对抗EDSV的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的制备方法进行研究。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]一种特异性结合减蛋综合征病毒的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示。
[0008]所述抗体或抗体片段为单克隆抗体或基因工程抗体；所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体和改形单克隆抗体。
[0009]所述抗体为单克隆抗体6F3H。
[0010]所述单克隆抗体6F3H的重链恒定区为IgG1型，轻链恒定区为Kappa型。
[0011]所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株6F3H，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021286，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年10月20日。
[0012]所述的抗体或抗体片段在制备检测减蛋综合征病毒的胶体金检测试剂中的应用。
[0013]本专利技术有益效果：
[0014]本专利技术提供一种抗EDSV的单克隆抗体，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F3H，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2021286，保藏地址为武汉大学，
保藏时间为2021年10月20日。该杂交瘤细胞株制备时，将EDSV衣壳蛋白fiber蛋白在大肠杆菌表达系统中进行表达，与疫苗佐剂混合后免疫BALB/C小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(NS0)进行融合，并进行融合细胞的亚克隆与筛选，获得抗EDSV的特异性单克隆抗体，特异性识别EDSV病毒效价达到1∶20000以上，为EDS的诊断制品开发提供生物材料。
[0015]本专利技术的单克隆抗体6H3F可用于免疫胶体金检测试纸条，该试纸条具有较好的特异性和灵敏度，试验表明病毒检测限为0.01ng/mL。
附图说明
[0016]图1纯化重组EDSV Fiber蛋白的凝胶电泳结果图。
[0017]其中，M，蛋白marker；1，大肠杆菌重组表达EDSV Fiber蛋白；2、3，纯化的大肠杆菌重组表达EDSV Fiber蛋白。
[0018]图2为BALB/C小鼠血清抗体检测结果图。
[0019]其中，Fib 1～4为Fiber蛋白免疫小鼠，NC1～2为阴性对照小鼠。
[0020]图3为单克隆抗体筛选结果图。
[0021]图4为单克隆抗体IPMA效价测定结果图。
[0022]图5为单克隆抗体6H3F特异性分析结果图。
[0023]图6为试纸条检测结果示意图。
具体实施方式
[0024]以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0025]实施例1BALB/C小鼠的免疫
[0026]抗原配制：取纯化的重组EDSV Fiber蛋白(由河南联科物联网科技有限公司自制，EDSV Fiber蛋白采用大肠杆菌重组表达制备，经Ni亲和纯化获得纯度85％以上蛋白。其凝胶电泳结果如图1所示)，与等体积弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合后，进行乳化。抗原中Fiber蛋白含量为100μg/mL。
[0027]免疫小鼠：取4只5周龄雌性BALB/C小鼠，采用上述抗原进行皮下多点注射，每只注射弗氏完全佐剂制备抗原100uL，两周后用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行第二次免疫，继续免疫两次，每次间隔两周。四次免疫后进行抗体效价检测，并取纯化的重组EDSV Fiber蛋白，用无菌PBS缓冲液稀释至100μg/500μL，然后直接进行腹腔注射500μL进行超免。另取2只小鼠作为阴性对照。
[0028]实施例2IPMA方法检测Balb/C小鼠抗体效价
[0029]小鼠血清抗体效价检测：免疫4次后的小鼠剪尾采血，每只采5μL加入195μL PBS缓冲液中，2000rpm离心5min分离血清；从1∶100开始，用PBS缓冲液连续倍比稀释，采用IPMA方法测定血清抗体效价。结果显示，免疫小鼠抗体效价可达1∶6400，对照小鼠未检出抗EDSV特异性抗体(图2)。
[0030]IPMA方法：提前24h制备鸭胚成纤维细胞，在96孔板进行培养，细胞长至60
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70％时，接入100TICD
50 EDSV病毒(A127株，GenBank Y09598)，在37℃培养箱中培养36h。弃去细胞培养液，加入10％(wt)多聚甲醛，100μL/孔，室温放置20min，然后用PBST缓冲液洗3遍，每孔加入5％(w/v)的脱脂奶，37℃温箱中孵育1h。添加梯度稀释的血清样品，每个样品设置3
个重复，在37℃温箱反应1h。孵育结束后，以PBST缓冲液洗6遍，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠的IgG多抗，在37℃温箱孵育1h。孵育结束再用PBST缓冲液洗6遍；然后加入AEC显色液进行显色，在显微镜下仔细观察，判定小鼠血清抗体效价。
[0031]图2为BALB/C小鼠血清抗体检测结果，其中Fib 1～4为Fiber蛋白免疫小鼠，NC1～2为阴性对照小鼠。
[0032]实施例3单克隆抗体细胞株融合
[0033]超免后第4天对小鼠进行脱颈处死，无菌手术剪和镊子剖开脾脏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合减蛋综合征病毒的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段为单克隆抗体或基因工程抗体；所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体和改形单克隆抗体。3.如权利要求1所述的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体6F3H。4.如权利要求3所述的抗体或抗体片段，...

【专利技术属性】
技术研发人员：余清卫，朱进华，王春笋，李清兰，孙静，苑述友，张洪文，申郑毅，赵逢冰，毛伟斌，杜勇杰，刘书平，刘家欣，刘长岗，张吉昌，戈林兴，王泽仁，马明扬，王金好，韩露，刘凡，张栓玲，李峥，王哲，
申请(专利权)人：河南联科物联网科技有限公司，
类型：发明
国别省市：