一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用。该抗猪圆环病毒2型Cap蛋白双价中和纳米抗体由两个相同氨基酸序列的单价纳米抗体组成，单价纳米抗体的可变区具有3个特定序列的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。该抗猪圆环病毒2型Cap蛋白双价中和纳米抗体既具有优异的特异性抗原结合能力，又具有稳定的PCV2病毒中和活性；在猪圆环病毒相关疾病防治、尤其是在PCV2感染后作为治疗药物中的应用具有广泛价值。泛价值。泛价值。

【技术实现步骤摘要】
一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是导致猪圆环病毒相关疾病的主要病原，诱发断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸道综合征、猪皮炎肾病综合征和母猪繁殖障碍等疾病。PCV2损伤感染猪机体免疫系统，导致严重免疫抑制，进而诱发与细小病毒、猪肺炎支原体等多种不同病原体的协同或继发感染，严重影响对相关疾病的诊断和治疗。多年来PCV2在我国规模化养猪场中广泛存在，已经成为制约我国养猪业的三大疫病之一，对我国生猪养殖业造成严重经济损失。PCV2感染后尚无特效治疗药物，当前接种疫苗仍是防控该病的有效手段。
[0003]目前商品化的PCV2疫苗主要包括全病毒灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗以及杆状病毒载体灭活疫苗等三种类型。这三种类型的疫苗在抗原制备难易程度、存储条件、免疫保护效果和生产成本等方面各有优缺点。从实际应用效果来看，不同品牌的PCV2疫苗都能起到一定的免疫保护作用，但其在疫苗毒株、抗原含量及来源、佐剂种类等方面存的差异导致免疫效果不尽相同。另一方面，随着分子生物学技术的发展，抗体药物已经成为生物药物最具潜力的产业之一，在动物疫病的诊断和治疗方面起着越来越重要的作用。抗体类试剂的应用为 PCV2的防控提供了新的选择方向。
[0004]已有多种基于单克隆抗体的诊断试剂、免疫抑制剂或治疗药物用于病原体的诊断以及免疫性疾病和病毒感染等的治疗。此外，针对不同肿瘤抗原的单克隆抗体结合相应的标记技术也早已用于临床实践中。单克隆抗体虽然在病原检测、疾病诊断和治疗等方面应用潜力巨大，但在某些应用条件下仍存在许多不足：较大的相对分子质量限制了其组织穿透能力；在机体内可引起免疫反应，进而被当做外来抗原被机体清除；生产制备过程复杂，生产成本高等。过高的使用成本限制了传统单克隆抗体在畜牧兽医领域作为治疗药物及其他形式的大规模应用。
[0005]迄今为止，国内外已有许多学者进行了PCV2单克隆抗体的制备和应用研究，但是由于成本等因素，PCV2相关的单克隆抗体目前主要作为诊断试剂使用。Hamers等发现在骆驼外周血中存在一种天然缺失轻链的重链抗体 (Heavy
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chain antibodies，HCAbs)，此后在羊驼等驼科动物、护士鲨等鱼类体内也发现存在类似抗体。通过克隆骆驼科动物HCAbs重链可变区，可得到只包含一个重链可变区的单域抗体(Variable domain of the heavy chain of HCAb， VHH)，这是目前已知具有抗原结合活性且结构稳定的最小抗体单位。其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，相对分子质量约15kDa，仅为常规抗体的1/10，因此又被称为纳米抗体(Nanobody，Nb)，为抗体小型化提供了新的研究方向。相对于传统的单克隆抗体而言，Nb具有相对分子质量小、结构稳定、可溶性极高，不易聚集，能耐强酸、强碱等致变性条
件、能识别独特的小表位、亲和活性高、组织穿透能力强等优点。Nb许多方面均优于传统抗体，在治疗性抗体药物研发、临床体外诊断、免疫学研究等领域具有很大的应用前景。
[0006]尽管纳米抗体有上述优点，但在临床应用过程中也存在半衰期短、有效性相对较低等不足。多价抗体是识别同种或不同表位的单价抗体的聚合物，比单价抗体具有更高的抗原亲和活力，并且能够显著延长在体内的半衰期，因此具有更广泛的功能和用途。传统全分子抗体由于结构复杂、二硫键多，在体内精确组装和体外纯化等方面的困难限制了双特异性全分子抗体的开发应用。而 Nb因其结构简单、易于通过分子生物学方法对其进行改造，容易被开发成双价或双特异性纳米抗体，并且易于通过原核或真核表达系统进行大量制备，能够极大降低生产成本。
[0007]因此，纳米抗体及基于纳米抗体改造的双价纳米抗体具有传统单克隆抗体无可比拟的优势，制备抗PCV2 Cap蛋白的双价中和纳米抗体能够为猪圆环病毒病的及时治疗提供大量廉价、特异性高、稳定性好的优质抗体。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供了一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体、双价中和纳米抗体及其应用，该抗PCV2 Cap蛋白的纳米抗体能充分发挥纳米抗体的优异性能，其双价中和纳米抗体既具有优异的特异性抗原结合能力，又具有稳定的PCV2 病毒中和活性；在猪圆环病毒相关疾病防治、尤其是在PCV2感染后作为治疗药物中的应用具有广泛价值，解决了现有技术中存在的问题。
[0009]本专利技术所采用的技术方案之一是：
[0010]一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体，其可变区具有3个互补决定区 CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成、CDR2由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成、CDR3由SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列组成。
[0011]优选的，所述纳米抗体序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸组成。
[0012]本专利技术所采用的技术方案之二是：
[0013]一种编码如上所述的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体的核苷酸，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示。
[0014]本专利技术所采用的技术方案之三是：
[0015]上述抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0016](1)使用PCV2全病毒灭活疫苗、PCV2病毒样颗粒(VLP)疫苗和PCV2 基因工程亚单位疫苗分别通过背部皮下多点注射方式免疫3只羊驼；
[0017](2)采集免疫后羊驼外周血，分别获得来自3只羊驼的淋巴细胞；
[0018](3)将步骤(2)所述得到的淋巴细胞进行总RNA提取，反转录制备cDNA，使用引物VHH1
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F和VHH1
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R对cDNA进行扩增，得到VHH基因片段；以第一轮PCR产物为模板，使用引物VHH2
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F和VHH2
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R进行第二轮PCR反应，其中引物VHH1
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F和VHH1
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R的序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，引物VHH2
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F和VHH2
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R序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；
[0019](4)将步骤(3)所述得到的VHH基因片段连接入表达载体，并转化至感受态细胞，构建抗体免疫库；
[0020](5)将来自步骤(2)所述3只不同羊驼的淋巴细胞分别按步骤(3)和 (4)进行处理，
分别构建抗体免疫库；
[0021](6)将步骤(4)所得抗体免疫库以PCV2病毒痒颗粒为包被抗原进行淘选，得到抗PCV2 Cap蛋白特异性纳米抗体序列；
[0022](7)验证抗PCV2 Cap本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体，其特征在于，其可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成、CDR2由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成、CDR3由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸组成。3.一种编码如权利要求2所述的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白纳米抗体的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.5所示。4.一种抗猪圆环病毒2型Cap蛋白双价中和纳米抗体，其特征在于，所述双价中和纳米抗体由两个如权利要求1或2所述的纳米抗体串联而成，所述双价中和纳米抗体具有如SEQ ID NO.6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲光刚，王长江，魏凤，管宇，郭广君，沈志强，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：