一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用，属于基因工程技术领域，其单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。本发明专利技术筛选获得了3株能够稳定分泌与EP0蛋白发生特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5、4C6和3B5。经单抗亚型鉴定，发现2C5为IgG2b/κ型，3B5和4C6均为IgG1/κ型。本发明专利技术所制备的针对RPV EP0蛋白的单克隆抗体能够为进一步分析EP0蛋白的功能提供研究基础。基础。基础。

【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，猪疱疹病毒属。PRV可以感染多种家畜及野生动物，主要引起发热﹑奇痒(猪除外)以及脑脊髓炎等症状，危害极其严重，是OIE规定必须上报的疫病之一。母猪感染PRV后，能够引起母猪繁殖障碍，如怀孕母猪的流产、死胎、弱胎甚至木乃伊胎。仔猪感染PRV后，能够引起仔猪出现神经症状，2周龄内的仔猪会发病死亡，致死率高达100％。成年猪耐过后呈现潜伏感染的特点，这也是其难以防治的重要原因。PRV病毒粒子呈椭圆或圆形，直径110
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150nm之间，主要由脂质间膜、间质层、核衣壳以及病毒基因组四部分组成。其基因组为线性双链DNA，长约150kb，可分为独特长片段(UL)、独特短片段(US)及短区段两侧的末端重复序列(TRS)和内部重复序列(IRS)。全长基因组可编码73个基因，根据转录时间顺序，可分为立早、早期、早/晚、晚期四类基因。EP0是PRV基因组编码的最主要的早期基因。迄今为止，EP0蛋白的功能尚未完全研究清楚，但PRV的EP0与HSV
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1的ICP0同源，在结构和功能上应有相似之处，故推测EP0蛋白可能在PRV的潜伏感染和激活过程中起着重要作用。有研究表明EP0是病毒基因组转录和复制的一个转录激活因子，体外提取的EP0重组蛋白可在细胞核提取物中促进人工合成的TATA box的启动子转录的起始。此外，EP0蛋白还具有拮抗干扰素调节的抗病毒作用，有利于PRV在宿主体内建立潜伏感染。
[0003]为了深入研究EP0蛋白在病毒感染中发挥的作用，并实现对PRV病毒感染的准确诊断，开发EP0蛋白特异性单克隆抗体，对深入研究EP0蛋白生物学功能具有重要意义，也将有助于PRV诊断检测试剂的开发。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术使用原核表达系统表达并纯化了EP0蛋白，免疫BALB/c小鼠，制备了特异性针对PRV EP0的单克隆抗体，并分析了单克隆抗体的特性，为更好地研究EP0蛋白功能提供了物质基础。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
[0007]进一步地，还包括前导序列和恒定区；所述重链前导序列的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链前导序列的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
[0008]本专利技术还提供编码如上述的单克隆抗体的基因，编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0009]本专利技术还提供包含上述的基因的表达载体。
[0010]本专利技术还提供包含上述的表达载体的宿主细胞。
[0011]本专利技术还提供一种如上述的单克隆抗体的制备方法，包括培养上述的宿主细胞，表达抗猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体的步骤。
[0012]本专利技术还提供如上述的单克隆抗体在制备检测或辅助诊断猪伪狂犬病毒的试剂中的应用。
[0013]本专利技术还提供如上述的单克隆抗体在制备检测或辅助诊断猪伪狂犬病毒EP0蛋白的试剂中的应用。
[0014]本专利技术公开了以下技术效果：
[0015]全长EP0基因中的GC含量为69％，GC含量较高，导致EP0基因扩增难度较高，本专利技术采用在扩增体系中加入DMSO的方式，增加其扩增效率，成功扩增了EP0全长基因。
[0016]本专利技术利用原核表达系统表达了PRV的EP0蛋白，并使用镍柱进行纯化，将纯化的重组EP0蛋白免疫BALB/c小鼠，并在其血清效价达到要求后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过ELISA筛选获得了3株能够稳定分泌与EP0蛋白发生特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5、4C6和3B5，成功制备了EP0蛋白的单克隆抗体。经IFA和Western blot验证，3株单克隆抗体均可与感染PRV的PK
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15细胞特异性反应，证明其具有良好的特异性。单克隆抗体亚型鉴定结果显示2C5为IgG2b/κ型，3B5和4C6均为IgG1/κ型。综上所述，本专利技术所制备的针对RPV EP0蛋白的单克隆抗体能够为进一步分析EP0蛋白的功能提供研究基础。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1为EP0基因的PCR扩增；其中，M：DNA 分子质量标准；1：EP0基因扩增产物；
[0019]图2为EP0蛋白的SDS
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PAGE及Western Blot鉴定；其中，A：EP0蛋白的SDS
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PAGE鉴定；B：EP0蛋白的Western Blot鉴定；M：预染蛋白分子质量标准；1：EP0蛋白16℃表达沉淀；2：EP0蛋白16℃表达上清；3：EP0蛋白25℃表达沉淀；4：EP0蛋白25℃表达上清；5：EP0蛋白37℃表达沉淀；6：EP0蛋白37℃表达上清；7：pET28a空载对照；
[0020]图3为EP0蛋白的纯化；其中，M：预染蛋白分子质量标准；1：EP0纯化前；2：EP0纯化后；3：pET28a空载对照；
[0021]图4为MAb 4C6、2C5和3B5和重组EP0蛋白反应的WB检测；其中，1：重组EP0蛋白；2：pET28a空载对照；
[0022]图5为MAb 4C6、2C5和3B5与PRV的IFA结果。
具体实施方式
[0023]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0024]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0025]除非另有说明，否则本文本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒EP0蛋白的单克隆抗体，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，还包括前导序列和恒定区；所述重链前导序列的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述轻链前导序列的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。3.编码如权利要求1所述的单克隆抗体的基因，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王迪，赵鸿远，陈冬杰，
申请(专利权)人：国家开放大学，
类型：发明
国别省市：