一种痘病毒人源单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种痘病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。本发明专利技术以大肠杆菌表达的痘苗病毒表面膜抗原A33蛋白作为抗原，从接种天花疫苗的志愿者的PBMCs中筛选A33蛋白特异性的记忆B细胞，然后对特异性B细胞进行反转和扩增，以获得抗体的可变区片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中，经哺乳动物细胞表达、纯化、进行一系列的功能检测，获得一株具有保护天花病毒的人源单克隆抗体。通过ELISA检测此株抗体与抗原有较好的结合能力，并且在体外中和试验和小鼠感染中具有较高的保护作用。这株人源抗体具有临床治疗和预防天花病毒的应用价值。花病毒的应用价值。花病毒的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种痘病毒人源单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术属于医药


技术介绍

[0002]天花(Smallpox)是由天花病毒(Variola virus)引起的一种烈性传染病，也是到目前为止，在世界范围被人类消灭的唯一一个传染病。天花病毒属于正痘病毒属(Orthopoxvirus)，该种属病毒还包括痘苗病毒(Vaccinia virus,VACV，用作天花的疫苗)，猴痘病毒(Monkeypox)和鼠痘病毒(Ectromelia virus，ECTV)等,这些痘病毒都高度同源。猴痘病毒或经过遗传改造的其他痘病毒都可能跨种间感染人类。由于大规模的免疫接种已经停止了近40年，目前大多数的人群对天花病毒没有免疫力。因此，构建高亲和力、广谱的特异性痘病毒的人源化抗体是非常必要的，可以提供对痘病毒的快速检测手段以及为疾病的免疫治疗提供战略抗体储备。
[0003]正痘病毒感染宿主细胞包括两种感染形式：胞内成熟毒粒(intracellular mature virion，IMV)和胞外包装毒粒(extracellular enveloped virion，EEV)。A33蛋白是其胞外包装毒粒EEV的外壳上一种重要的蛋白，它是由正痘病毒基因组中的A33R基因编码的蛋白，在感染的后期表达。A33蛋白是病毒在感染宿主细胞迁移过程中的重要的蛋白，研究表明，正痘病毒中的痘苗病毒的外膜蛋白A33，是抗痘病毒天然抗体应答的重要靶标。通过抗原抗体反应的机理，可以通过抗原来筛选针对抗原特异性的记忆性B细胞。相较鼠源单抗或者嵌合型抗体缺少细胞介导的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用等缺点，从而降低疗效甚至引起过敏反应，而使用A33作为抗原对特定记忆B细胞进行分选是开发针对痘病毒的人源化中和抗体的非常有效的方法。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术以A33蛋白作为抗原，再通过流式分选，从接种天花疫苗的志愿者的外周血(PBMCs)中筛选可以特异性结合A33的B淋巴细胞，然后对单个的B淋巴细胞进行RT
‑
PCR和PCR扩增，从而得到抗体轻重链的可变区，进一步与恒定区连接至表达载体中，经过在哺乳动物细胞中表达纯化后，对这株抗体的功能进行检测，包括与A33结合情况，体外中和实验。
[0005]本专利技术提供的痘病毒人源单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
[0006]在本专利技术的具体实施方式中，所述痘病毒人源单克隆抗体的重链和轻链的恒定区序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
[0007]在本专利技术的具体实施方式中，所述痘病毒人源单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
[0008]在本专利技术的具体实施方式中，所述痘病毒人源单克隆抗体与痘病毒A33蛋白特异性结合，从而抑制痘病毒对细胞的感染，起到保护作用。
NO.6所示。
[0031]所述痘病毒人源单克隆抗体与痘病毒A33蛋白特异性结合，从而抑制病毒对细胞的感染，起到保护作用。
[0032]以A33为抗原来筛选抗天花病毒的人源化单克隆抗体，所述方法主要包括以下步骤：
[0033]⑴
以pET28a(+)作为表达载体，构建含有编码A33的重组质粒，将重组质粒转化DH5α感受态细胞表达、纯化；
[0034]⑵
以A33作为抗原从接种天花病毒疫苗的志愿者的外周血中筛选特异性B细胞，得到抗体轻重链可变区序列，先构建单链抗体，再通过ELISA进一步筛选；
[0035](3)将确定的单链抗体构建成完整的抗体IgG形式，再将质粒转染293细胞，纯化获得人源化抗体。
[0036]实施例1：
[0037]正痘病毒中的痘苗病毒的外膜蛋白A33蛋白的表达纯化
[0038]鉴于A33在痘病毒感染中的作用，我们比对天花病毒、鼠痘病毒、豆苗病毒、猴痘病毒中A33胞外氨基酸序列，A33在痘病毒中高度保守，同源性高达92.48％，这也证明了A33是抗痘病毒天然抗体应答的重要靶标。
[0039]随后选取pET28a(+)做为表达载体，并选取NcoI和BamHI两个酶切位点之间作为A33蛋白基因的插入位点获得重组质粒，将该重组质粒转化到BL21大肠杆菌感受态细胞中，当菌液的OD600在0.6
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0.8之间时加入IPTG进行诱导，3—4h左右，收集包涵体，再将包涵体通过稀释法进行复性，最后将复性的包涵体用Ni柱纯化并通过SDS
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PAGE鉴定蛋白纯度，如图1所示。
[0040]痘病毒特异性记忆B淋巴细胞的分选
[0041]从接种过天花疫苗志愿者的PBMCs中分离出淋巴细胞，重悬到107/ml的密度并与A33及抗人PE
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CD19(Biolegend,302208)，抗人FITC
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IgM(Biolegend,314506)，抗人percp/Cy5.5
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CD27(Biolegend，124214)混匀4℃孵育30min，用PBS洗涤一次后，将细胞用300uL 1640培养基重悬放入无菌的分选管内。经过FACSAria III分选收集IgM
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,CD19+,CD27+的单个细胞于96孔板，得B淋巴细胞，如图2所示。
[0042]抗体序列可变区扩增及单链抗体构建
[0043]将得到的B淋巴细胞通过反转录酶Ⅲ逆转录，逆转录引物如表1。
[0044]表1.逆转录反应引物
[0045][0046]将逆转录产物作为模板进行PCR，设计相应引物，反应如下：94℃2min；98℃30s，55℃1min，68℃1min30s进行35个循环；然后68℃5min。再将此轮产物作为模板进行第二轮扩增，反应条件如下：94℃2min；98℃30s，60℃1min；68℃1min30s进行35个循环；然后68℃5min。扩增产物通过DNA凝胶电泳检测，如图3。
[0047]将扩增的序列送测序，通过软件分析抗体可变序列，构建单链抗体，设计如下：SP
‑
VL
‑
Linker
‑
VH
‑
3X Flag。
[0048]其中Leader sequences的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所述，Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所述。
[0049]重链可变区的氨基酸具有序列表中SEQ ID NO.1所述序列和核苷酸具有序列表中SEQ ID NO.2所述序列，轻链可变区的氨基酸具有序列表中SEQ ID NO.3所述序列和核苷酸具有序列表中SEQ ID NO.4所述序列。
[0050]重链和轻链的恒定区具有序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所述序列。
[0051]重链和轻链的氨基酸具有序列表中SEQ ID NO.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.痘病毒人源单克隆抗体，其特征在于，包含氨基酸具有序列表中SEQ ID NO.1所述序列或核苷酸具有序列表中SEQ ID NO.2所述序列的重链可变区结构域、氨基酸具有序列表中SEQ ID NO.3所述序列或核苷酸具有序列表中SEQ ID NO.4所述的轻链可变区结构域。2.权利要求1所述痘病毒人源单克隆抗体，其特征在于，所述重链的氨基酸具有序列中SEQ ID NO.5所述序列。3.权利要求1所述痘病毒人源单克隆抗体，其特征在于，所述轻链的氨基酸具有序列表中SEQ ID NO.6所述序列。4.权利要求1所述痘病毒人源单克隆抗体，其特征在于，还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸具有序列表中SEQ ID NO.7所述序列，所述轻链恒定区的氨基酸具有序列表中SEQ ID NO.8所述序列。5.权利要求1
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4所述痘病毒人源单克隆抗体在抗痘病毒感染中的应用。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：方敏，顾秀玲，张毓凡，姜威，卢娇，顾光磊，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：