【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药微生物领域，具体涉及一种禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法及培养基。
技术介绍
1、禽巴氏杆菌病是一种败血性传染病，主要引发原为多杀性巴氏杆菌。临床症状分为最急性型、急性型和慢性型，其中最急性病例死亡速度极快。主要表现为呼吸困难、腹泻和发热等，且发病率和死亡率均很高，给我国养鸡业带来巨大的经济损失。禽巴氏杆菌病的预防以疫苗接种为主，使用的疫苗主要有禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗、蜂胶灭活疫苗、油乳剂灭活疫苗和禽多杀性巴氏杆菌活疫苗等。
2、在利用疫苗接种方式防控禽巴氏杆菌病中，禽多杀性巴氏杆菌的高密度培养成为关键及研究的焦点。禽多杀性巴氏杆菌培养时，对培养基营养和生长环境均有很高的要求，目前主要以扁瓶固体培养、三角瓶液体培养为主；即使一些生产企业采用发酵罐进行禽多杀性巴氏杆菌培养，也仅仅是传统培养工艺巴氏杆菌的简单放大，仍存在培养基成本高、细菌浓度低、生产成本高等难题。例如cn110643522a公布了一种禽多杀性巴氏杆菌的培养基、培养方法及其应用，所述发酵培养的工艺设置分为两个阶段，第一阶段适应禽多杀性巴氏杆菌代谢产生酸性物质的特点，严格控制ph值为7.1～7.5，第二阶段关闭通气和关闭ph调节，使活菌处于氧气含量低的环境中；20l发酵结束，经检验活细胞数浓度达到2.0×1010～2.5×1010cfu/ml。目前，生产企业一般利用巴氏杆菌专用培养基进行禽多杀性巴氏杆菌发酵，培养基成本约为10元/l。培养基中合适的碳源、氮源、无机盐、生长因子的种类及浓度，不仅可以满足细菌生长对营养的需求，而且可以避免营
技术实现思路
1、针对上述存在问题，本专利技术目的是提供一种禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法及培养基。高密度发酵技术具有降低设备投入、降低生产成本、提高生产效率、实现节能减排降耗等优势。因此，本专利技术开展禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵对禽多杀性巴氏杆菌活/灭活疫苗制备具有重要意义，可降低其生产成本，提高该疫苗在养鸡业中的应用，实现禽巴氏杆菌病的有效防控。
2、为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术方案：
3、一种禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，包括如下步骤：
4、s1、制备禽多杀性巴氏杆菌的种子液；
5、s2、按照2％接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度维持在37℃，ph调节至7.5，溶氧水平维持在30％左右；
6、s3、根据在线检测活细胞电容值确定活菌浓度变化，培养2h后，当检测电容值停止升高，则采用恒葡萄糖浓度补料方式将葡萄糖浓度控制在1.5g/l继续培养；
7、s4、培养4h后，当检测电容值再次停止升高，且溶氧值突然升高，则采用溶氧反馈补料方式补加营养组分，使溶氧水平维持在30％；补加营养组分为酵母粉、蛋白胨、三甲基甘氨酸、vb1、vh的混合溶液；当检测电容值再次停止升高，结束发酵。
8、优选的，所述发酵培养基组成：葡萄糖4-6g/l、酵母粉4-6g/l、蛋白胨8-12g/l、硫酸铵3-5g/l、硫酸镁0.8-1.2g/l、磷酸二氢钾1.5-2.5g/l、柠檬酸1.5-2.5g/l、氯化钾1.5-2.5g/l、三甲基甘氨酸1.5-2.5g/l、vb1 20-30mg/l、vh 8-12mg/l。
9、更优选的，所述发酵培养基组成：葡萄糖5g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、硫酸铵4g/l、硫酸镁1.0g/l、磷酸二氢钾3.0g/l、柠檬酸3.0g/l、氯化钾2.0g/l、三甲基甘氨酸2.0g/l、vb1 25mg/l、vh 10mg/l。
10、优选的，所述补加营养组分为：4-6g/l酵母粉、8-12g/l蛋白胨、1.5-2.5g/l三甲基甘氨酸、20-30mg/l vb1及8-12mg/l vh的混合溶液。
11、更优选的，所述补加营养组分为：5g/l酵母粉、10g/l蛋白胨、2.0g/l三甲基甘氨酸、25mg/l vb1及10mg/l vh的混合溶液。
12、本专利技术还提供上述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法在禽多杀性巴氏杆菌活/灭活疫苗中的应用。
13、本专利技术有益效果：
14、本专利技术通过在线活细胞检测系统实时监测禽多杀性巴氏杆菌生长情况，基于活细菌所带电荷，根据在线检测活细胞电容值准确掌握活菌浓度变化，精准确定葡萄糖及其他营养组分的补加时机和补加方式，并结合溶氧反馈，理性调控发酵过程，实现禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵。
15、本专利技术完成禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵及产业化应用，细菌浓度及活菌数目分别是现用生产工艺的5.21倍、5.26倍。采用本专利技术方法及培养基，禽多杀性巴氏杆菌活菌数目提高至4.50×1010cfu/ml以上，并且降低生产成本至现用生产工艺的1/10左右。
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1.一种禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：所述发酵培养基组成：葡萄糖4-6g/L、酵母粉4-6g/L、蛋白胨8-12g/L、硫酸铵3-5g/L、硫酸镁0.8-1.2g/L、磷酸二氢钾1.5-2.5g/L、柠檬酸1.5-2.5g/L、氯化钾1.5-2.5g/L、三甲基甘氨酸1.5-2.5g/L、VB1 20-30mg/L、VH 8-12mg/L。
3.如权利要求1所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：所述发酵培养基组成：葡萄糖5g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁1.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、柠檬酸3.0g/L、氯化钾2.0g/L、三甲基甘氨酸2.0g/L、VB1 25mg/L、VH 10mg/L。
4.如权利要求1所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：所述补加营养组分为：4-6g/L酵母粉、8-12g/L蛋白胨、1.5-2.5g/L三甲基甘氨酸、20-30mg/L VB1及8-12mg
5.如权利要求1所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：所述补加营养组分为：5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨、2.0g/L三甲基甘氨酸、25mg/L VB1及10mg/L VH的混合溶液。
6.如权利要求1所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：步骤S3中根据葡萄糖消耗速率调节补加速率将葡萄糖浓度控制在1.5g/L，持续补加直至发酵结束。
7.如权利要求1所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：步骤S4中补加营养组分直至发酵结束。
8.权利要求1-7任一项所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法在禽多杀性巴氏杆菌活/灭活疫苗的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：所述发酵培养基组成：葡萄糖4-6g/l、酵母粉4-6g/l、蛋白胨8-12g/l、硫酸铵3-5g/l、硫酸镁0.8-1.2g/l、磷酸二氢钾1.5-2.5g/l、柠檬酸1.5-2.5g/l、氯化钾1.5-2.5g/l、三甲基甘氨酸1.5-2.5g/l、vb1 20-30mg/l、vh 8-12mg/l。
3.如权利要求1所述禽多杀性巴氏杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：所述发酵培养基组成：葡萄糖5g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、硫酸铵4g/l、硫酸镁1.0g/l、磷酸二氢钾3.0g/l、柠檬酸3.0g/l、氯化钾2.0g/l、三甲基甘氨酸2.0g/l、vb1 25mg/l、vh 10mg/l。
4.如权利要求1所述禽多杀性巴...
【专利技术属性】
技术研发人员：程立坤，夏小静，林初文，张慧辉，李晶晶，孙宇，赵修报，付强，魏小兵，滕战伟，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：
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