一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体、制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的优选抗原表位融合蛋白，将其命名为PRV

【技术实现步骤摘要】
Pseudoraibies Virus，PRV)的快速特异性检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的优选抗原表位融合蛋白，将其命名为PRV
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BC21，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0007]进一步的，本专利技术提供一种纳米抗体PRV
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BC21的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)重组真核表达载体的构建：通过PCR扩增、酶切，将编码纳米抗体PRV
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BC21的DNA序列连接至表达载体中获得阳性质粒；
[0009](2)将步骤(1)中阳性质粒转化宿主细胞，诱导表达纳米抗体PRV
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BC21。
[0010]进一步的，所述表达载体可以为真核表达载体或原核表达载体，优选的，所述表达载体为真核表达载体，所述表达载体可选自：pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pB SII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET 15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP
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N1(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR
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α(PCT Pub.No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco
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BRL，Grand Island，NY)等。
[0011]所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母或真核细胞，优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可选自例如：中国仓鼠的卵巢细胞CHO、猴的肾脏细胞COS细胞、人的胚肾细胞HEK
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293、人的子宫颈癌细胞HELA等。
[0012]进一步的，本专利技术提供一种猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条，采用纳米抗体PRV
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BC21与胶体金试纸条结合方式对猪伪狂犬病毒实现快速检测，实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了纳米抗体PRV
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BC21在快速检测方面的初步应用。
[0013]进一步的，本专利技术提供的猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条包括底板、吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，从底板上从上到下依次粘贴吸水垫纸、NC膜、金垫、样品层析垫，其中所述金垫上设置有胶体金标记的纳米抗体PRV
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BC21；
[0014]所述NC膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区喷涂PRV包被抗原，所述质控区喷涂有与胶体金标记的纳米抗体PRV
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BC21特异结合的抗体。
[0015]进一步，本专利技术提供一种猪伪狂犬病毒的快速检测试纸条的制备方法，
[0016]1)纯化纳米抗体PRV
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BC21，透析待用；
[0017]2)胶体金标记纳米抗体PRV
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BC21；
[0018]3)BSA封闭反应；
[0019]4)离心后用含1％BSA的PBS液洗涤保留沉淀；
[0020]5)复溶后喷涂金标垫；
[0021]6)包被NC膜；
[0022]7)在室温低湿度条件下进行干燥；从底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫、样品层析垫，裁切待用；
[0023]8)对胶体金试纸条进行应用测试，得出胶体金试纸条的检测限为10ng/mL级别，能满足快速检测PRV的要求。
[0024]有益效果
[0025]本专利技术提供了一种特异性识别PRV的纳米抗体PRV
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BC21，并公开了所述纳米抗体
的氨基酸序列。本专利技术提供的特异性纳米抗体，测序结果显示纳米抗体PRV
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BC21的序列与人的VH高度相似，ELISA结果显示其具有很高的结合力，推测有可能是骆驼体内自然存在的VH
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HcAbs，可能会拥有很大的应用前景。这种纳米抗体可以特异性的识别PRV，可将其作为免疫学检测的材料，具有非常广阔的应用前景。
[0026]通过对比试验证明在PRV检测中纳米抗体PRV
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BC21比商品化的单克隆抗体更灵敏，纳米抗体PRV
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BC21与胶体金标记技术相结合，灵敏度高，检测PRV的检测限可达到1ng/mL。特异性强，交叉反应少，本专利技术所述的试纸条对猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV抗体阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒TGEV抗体阳性血清、猪流行性腹泻病毒PEDV抗体阳性血清、猪细小病毒PPV抗体阳性血清和猪瘟病毒SFV抗体阳性血清以及鸡新城疫病毒NDV病阳性血清、犬瘟热病毒CDV病阳性血清和兔戊型HEV肝炎病毒病阳性血清的交叉反应都为阴性。首次开发的胶体金试纸条实现了快速检测，将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了对PRV快速检测的初步应用。
附图说明
[0027]图1为PRV的gB和gC抗原表位融合蛋白3D抗原表位模拟图
[0028]图2为PRV的gB
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gC抗原表位融合蛋白表达与纯化，其中，M为marker，1
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4为PET
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28a
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BC重组阳性质粒SDS
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PAGE鉴定图(不同上样孔)，在大约27kD位置都出现与预期分子量相当的特异性阳性条带，证明重组病毒PRV的gB
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gC抗原表位融合蛋白表达成功；
[0029]图3为ELISA方法检测双峰驼血清效价，其中，阴性对照为免疫前骆驼血清；
[0030]图4为3轮淘选后融合蛋白特异性纳米抗体ELISA结果；
[0031]图5为试纸条剖面结构，其中1为PVC底板，2为样品层析垫，3为金垫，4为NC膜，5为吸水垫纸；
[0032]图6为PRV
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BC21胶体金试纸条的不同毒株交叉性反应检测，其中1为阴性对照，2为PRV JS2012株，3为PRV HNB株，4为PRV JL15(2021)株，5为疫苗株Bartha
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K61。
[0033]图7为PRV
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BC21胶体金试纸条的的敏感性实验，其中1
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6分别对应1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000，1:1000000稀释度下的检测结果，7为阴性对照。
具体实施方式
[0034]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体，所述纳米抗体靶向的是PRV的gB蛋白和gC蛋白的优选抗原表位融合蛋白，将其命名为PRV
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BC21，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。2.如权利要求1所述的一种纳米抗体PRV
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BC21的制备方法，包括以下步骤：(1)重组真核表达载体的构建：通过PCR扩增、酶切，将编码纳米抗体PRV
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BC21的DNA序列连接至表达载体中获得阳性质粒；(2)将步骤(1)中阳性质粒转化宿主细胞，诱导表达纳米抗体PRV
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BC21。3.如权利要求2所述的制备方法，所述表达载体可以为真核表达载体或原核表达载体，优选的，所述表达载体为真核表达载体，所述表达载体可选自：pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pB SII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET 15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP
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N1(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR
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α(PCT Pub.No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco
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BRL，Grand Island，NY)等。所述宿主细胞为大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆璐，董春霞，费磊，陈忠琼，凌洪权，欧阳吴莉，蒋佳利，姜东平，杨娅，
申请(专利权)人：重庆市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：