猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。本发明专利技术所述试剂盒，具有良好的敏感性、特异性和诊断能力，重复性与稳定性也良好。好。好。

Chemiluminescence detection kit of porcine pseudorabies virus gE and GI antibodies and its application

【技术实现步骤摘要】
猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，涉及一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种以动物发热、奇痒及中枢神经障碍为主要症状的一种急性传染病。猪是PRV的主要宿主，成年猪一般为隐性感染，但终身带毒和排毒，可致妊娠母猪流产、死产或产木乃伊胎。因其具有流行快，传播途径多，病死率高的特点，现在已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一。每年给养猪业造成了巨大的经济损失，被世界动物卫生组织列为二类动物传染病。该病的控制措施主要是隔离感染猪群、疫苗接种和淘汰隐性感染动物。分离伪狂犬病病毒，通过免疫荧光、免疫过氧化物酶活特异性抗血清中和试验对特征性细胞病变加以鉴定。此外，PCR鉴定病毒DNA也比较成熟。可以用病毒中和试验、乳胶凝集试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测伪狂犬病抗体。
[0003]伪狂犬病可以通过接种疫苗来进行控制，因此区分免疫动物和感染动物就变得非常重要。检测疫苗免疫抗体和自然感染抗体可以通过接种基因缺失疫苗来实现。鉴别诊断方法就是在使用基因缺失疫苗的基础上应用的一类诊断方法。DNA同源重组缺陷型、基因缺失型和天然缺陷型疫苗因缺少特异性糖蛋白(gG、gE或gC)，可以用于鉴别免疫抗体与自然感染抗体。由于PRV中存在多个非必需糖蛋白基因，缺失这些基因的病毒突变株不能产生被缺失基因所编码的糖蛋白，但又不影响病毒在细胞上的增殖与免疫原性。将这种基因缺失疫苗注射动物后，动物不能产生针对缺失蛋白的抗体。因此，可通过血清学方法将自然感染野毒的血清学阳性猪与注苗猪进行鉴别。
[0004]缺失疫苗缺失的糖蛋白基因主要为gE和gI基因，对于使用gE和gI基因双缺失疫苗免疫的养殖场，在检测免疫抗体水平的时候，需要配合使用野毒鉴别试剂盒进行筛选，确定阳性抗体的来源，鉴别区分免疫抗体和自然感染抗体，筛选出隐性感染猪，对野毒阳性猪及时进行淘汰，建立健康的阴性猪群，但市场上常见的商品化鉴别试剂盒多为gE单基因缺失ELISA试剂盒，常常不能满足临床检测的需求。因为在各种特异性糖蛋白中，由于gE蛋白抗体而被目前普遍认为是最重要的感染指标，但是gE抗体的产生时间和应答水平存在个体差异，有时在感染的猪机体内并不能检测到gE抗体或gE抗体产生的时间延迟，所以，以单独包被gE蛋白的试剂盒检测猪伪狂犬病毒，其结果会出现假阴性，准确性不高。同时由于动物感染后在不同时期会出现不同的蛋白抗体，因此检测单一的蛋白抗体也是不准确的。所以对于诊断猪伪狂犬来说，至少应该检测一种以上的蛋白抗体，来提高检测的准确性。对于那些已经免疫后又感染的动物，由于具有中和抗体使得病毒的复制很慢，导致体内具有很低浓度的特异性蛋白，但商品化的ELISA试剂盒敏感性低，使这些低浓度的特异性蛋白很难被检测到，导致部分感染动物漏检。
[0005]化学发光免疫分析技术(CLIA)是在放射性免疫和酶联免疫分析的基础上逐渐发
展建立的，具有试验材料易获取，对试验环境、设备及人员的要求较低、试验操作简便、检测速度快等优点。但是化学发光不需要不需要额外的光源或背景荧光，所有的能量都来自于样本本身的化学反应，消除了背景影响，避免了外来因素(光源稳定性、光散射、光波选择器)的干扰，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物。同时光信号强度和待测物质的浓度呈线性关系，可以根据仪器的标定曲线，精确算出待测物的浓度。因此敏感性、特异性、稳定性和安全性上明显优于放射性免疫和酶联免疫分析方法。

技术实现思路

[0006]针对猪伪狂犬病毒检测所面临的问题，本专利技术拟提供一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，该试剂盒相对于市场上常用的试剂盒产品，敏感性更高，特异性更强，诊断能力亦优于其他市售产品。
[0007]一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包括化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液；
[0008]所述化学发光包被板的包被过程为：将gE纳米抗体和gI纳米抗体加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使gE纳米抗体和gI纳米抗体的浓度均为0.25ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到化学发光板中，2
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8℃孵育16
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18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA
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PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2
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8℃保存；
[0009]所述gE纳米抗体的氨基酸序列为；QVQLQESGGGSVGSSNSCVASGYTNSGGKRWFRQAPGKEREKVAHSSTSTYYADSVKGRFTDSPAKNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMVGSSNFGDIWYTGRDEYNYWGQGTQVTVSSAAAY(SEQ ID NO.1)
[0010]所述gI纳米抗体的氨基酸序列为：QVQLQESGGGSGVSPNSCVASQSPNSGGKRWFRQAPGVTKVAHSSTSTYYADSVKGQSPTDSPAKNAKNTSPVMNSLKPEDTAMVGSSNFGDIWWYGYNYWKTGVQSSSAAAY(SEQ ID NO.2)；
[0011]所述血清稀释液为含5％(v/v)山羊血清和0.5％(v/v)Tween
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20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
[0012]所述发光底物A为含有0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液；
[0013]所述发光底物B为含有0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/L、pH＝5.2的醋酸铵溶液。
[0014]所述10倍浓缩洗涤液为0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5％(v/v)Tween
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20，pH＝7.4。
[0015]所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，检测步骤如下：将待检血清用血清稀释液稀释1：100倍后加入到化学发光包被板中，同时设置阳性对照血清和阴性对照血清作为对照，将化学发光包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA
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PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15
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25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
[0016]所述的一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，其优势在于：利用该试剂盒可以确定抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒gE和gI抗体化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液，其特征在于：所述化学发光包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，每孔内底部联合包被gE纳米抗体和gI纳米抗体；所述化学发光包被的联合包被过程为：将gE纳米抗体和gI纳米抗体加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使gE纳米抗体和gI纳米抗体的浓度均为0.25ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到化学发光板中，2
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8℃孵育16
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18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA
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PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2
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8℃保存；所述阳性对照血清是经伪狂犬病毒免疫健康猪获得的猪血清；所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体。2.根据权利要求1所述血清稀释液为含5％(v/v)山羊血清和0.5％(v/v)Tween
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20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。3.根据权利要求1所述发光底物A为含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新杰，曾政，董春霞，骆璐，欧阳吴莉，白雪冬，孙晓明，费磊，周春国，周小平，
申请(专利权)人：重庆市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：