猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、O型阳性对照血清、A型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液。本发明专利技术所述试剂盒，能同时检测并区分O型和A型猪口蹄疫病毒，具有良好的敏感性、特异性和诊断能力，重复性与稳定性也良好。重复性与稳定性也良好。重复性与稳定性也良好。

Microplate chemiluminescence detection kit for Swine Foot and mouth disease virus type O and a antibodies and its application

【技术实现步骤摘要】
猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，涉及一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒。

技术介绍

[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot
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and
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mouth disease virus，FMDV)引起的,发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV属于小核糖核酸病毒科，口疮病毒属。根据病毒的血清学特性，目前已知全世界有7个主型：A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲I型。同一血清型内又有若干个不同的亚型，各血清型之间几乎没有交叉免疫性，同一血清型内各亚型之间仅有部分交叉免疫性。
[0003]口蹄疫是亚洲、非洲和南美洲许多发展中地区偶蹄类动物最具传染性和经济破坏性的疾病之一，我国流行的口蹄疫以A型和O型为主，预防监测和免疫扑杀是我国目前防控口蹄疫的主要手段。我国动物免疫使用的主要为口蹄疫病毒O型
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A型二价疫苗。OIE推荐的检测口蹄疫抗体的标准方法为中和试验，但中和试验需要使用活病毒，需在特殊实验室完成，且操作费时，酶联免疫吸附分析法具有操作试验操作简便、检测速度快的优点，因此得到广泛应用。市场上已经有许多检测单一抗体类型的商品化ELISA试剂盒，但这些ELISA方法常常不能满足临床检测的需求，无法判定抗体类型，不利于确认可疑动物、无感染动物和免疫效力的评价。VP1抗体的产生时间和应答水平存在个体差异，有时在免疫或感染的猪机体内并不能检测到VP1抗体或VP1抗体产生的时间延迟，所以，其结果会出现假阴性，准确性不高。对于那些已经免疫后又感染的动物，由于具有中和抗体使得病毒的复制很慢，导致体内具有很低浓度的特异性蛋白，但商品化的ELISA试剂盒敏感性低，使这些低浓度的特异性蛋白很难被检测到，导致部分感染动物漏检。因此，需要一种更敏感性、高效的检测方法，对预防和控制口蹄疫的发生和流行将具有重要意义。
[0004]微孔板式化学发光免疫分析技术(CLIA)是在放射性免疫和酶联免疫分析的基础上逐渐发展建立的，具有试验材料易获取，对试验环境、设备及人员的要求较低、试验操作简便、检测速度快等优点。但是化学发光不需要不需要额外的光源或背景荧光，所有的能量都来自于样本本身的化学反应，消除了背景影响，避免了外来因素(光源稳定性、光散射、光波选择器)的干扰，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物。同时光信号强度和待测物质的浓度呈线性关系，可以根据仪器的标定曲线，精确算出待测物的浓度。因此敏感性、特异性、稳定性和安全性上明显优于放射性免疫和酶联免疫分析方法。
[0005]目前市面上同时检测和区分猪口蹄疫O型和A型抗体检测的基于化学发光免疫分析方法制备的微孔板式试剂盒还没有。本试剂盒为口蹄疫的诊断提供了更加灵敏、便捷、有效、快速的检测方法，而且更适用于低浓度样本的检测以及疾病的早期诊断，对应预防和控制口蹄疫的发生和流行具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0006]针对猪口蹄疫病毒检测所面临的问题，本专利技术拟提供一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，该试剂盒相对于市场上常用的试剂盒产品，敏感性更高，特异性更强，可以区分猪口蹄疫O型和A型抗体类型，诊断能力亦优于其他市售产品。
[0007]一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包括化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、O型阳性对照血清、A型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液；
[0008]所述化学发光包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，奇数列包被猪口蹄疫病毒O型VP1纳米抗体蛋白，偶数列包被猪口蹄疫病毒A型VP1蛋白；
[0009]所述包被过程为：将O型VP1纳米抗体蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到奇数列化学发光板中。将A型VP1纳米抗体蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到偶数列化学发光板中，2
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8℃孵育16
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18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA
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PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2
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8℃保存；
[0010]所述O型VP1纳米抗体蛋白为重组蛋白，其氨基酸序列为：LQEWGAGLYSWALKPTSELSLTPGKGDQWGQGTLVTVLEWIYGSWIRQPGEIWNHDGFNPVASLKSQFSLKSLSVTATAADVYYCAEGRWEDSLRVTISVDTSNNSKNNSSASTKG(SEQ ID NO.1)；
[0011]所述A型VP1纳米抗体蛋白为重组蛋白，其氨基酸序列为：LQERRAVTLDGLQESGGTPGGAVCKALSLSGFIFSSYDMAWVRQAPSKGYVLEASISSGGSFTYYGAAVKGGRTIISRDGTNGQSTVRLQLNRAEDAGTFYCAKAADSDNLYAWSADNIDAWGHEVIVSSLDKG(SEQ ID NO.2)；
[0012]所述血清稀释液为含5％(v/v)酪蛋白和0.5％(v/v)Tween
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20的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
[0013]所述发光底物A为含有0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1％的羟基香豆素；溶剂为0.05mol/L、pH＝8.0的Tris缓冲液；
[0014]所述发光底物B为含有0.07mmol/L的维生素C和3mmol/L氨基酸氧化酶，溶剂为0.05mol/L、pH＝5.2的醋酸铵溶液。
[0015]所述10倍浓缩洗涤液为0.02mol/L的磷酸二氢钠、0.08mol/L的磷酸氢二钠、1.37mol/L的氯化钠和0.5％(v/v)Tween
‑
20，pH＝7.4。
[0016]所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，检测步骤如下：将待检血清用血清稀释液1：50倍稀释，取100uL分别加入到化学发光包被板奇数列和偶数列中，同时在奇数列设置O型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照，在偶数列设置A型阳性对照血清和阴性对照血清作为对照。将化学发光包被板于37℃反应15min；用洗涤液洗涤5次，加入用5％BSA
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PBST稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体，37℃孵育15min；再经洗涤液洗涤5次，加入发光底物A和发光底物B，15
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25℃反应5min，用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。
[0017]所述的一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其优势在于：利用该试剂盒可以检测口蹄疫病毒感染或接本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪口蹄疫病毒O型和A型抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含化学发光包被板、酶标抗体、血清稀释液、O型阳性对照血清、A型阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物A、发光底物B和10倍浓缩洗涤液，其特征在于：所述化学发光包被板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，奇数列包被猪口蹄疫病毒O型VP1纳米抗体蛋白，偶数列包被猪口蹄疫病毒A型VP1纳米抗体蛋白；所述包被过程为：将O型VP1纳米抗体蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到奇数列化学发光板中；将A型VP1纳米抗体蛋白加入到pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，使蛋白的浓度均为1ug/mL，以100uL/孔的加样量将蛋白包被液加入到偶数列化学发光板中，2
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8℃孵育16
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18h；甩掉化学发光板中的蛋白包被液，向每孔中加入150uL/孔的5％BSA
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PBST进行封闭，37℃封闭2h；甩掉化学发光板中的封闭液，25℃干燥2h，放入干燥剂，密封包装，2
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8℃保存；所述O型阳性对照血清是经疫苗免疫健康猪获得的猪血清；所述A型阳性对照血清是经疫苗免疫健康猪获得的猪血清；所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体。2.根据权利要求1所述血清稀释液为含5％(v/v)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新杰，曾政，董春霞，骆璐，陈峰，白雪冬，孙晓明，费磊，陈汇鑫，张远亮，
申请(专利权)人：重庆市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：