一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其制备方法与应用技术

一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其制备方法与应用，属于食品安全技术领域。为了解决现有技术检测沙门氏菌中存在的问题，本发明专利技术提供了一种适体生物传感器，其检测原理为SMBs

An aptamer biosensor for detecting Salmonella and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其制备方法与应用，属于食品安全


技术介绍

[0002]食源性致病菌作为引起食物中毒和急性肠道疾病的主要原因之一，对全球食品尤其是乳制品安全造成了重大影响。
[0003]沙门氏菌(S.typhimurium)作为常见的食源性病原体之一，其污染可使人类患多种疾病，沙门氏菌会在潜伏12
‑
72小时后引发腹泻、发热和腹痛等症状，严重时可导致脱水、休克、虚脱甚至败血症等。据统计，全世界每年约有1600万人感染沙门氏菌，其中约60万人死亡。沙门氏菌已经被WHO列为具有严重危害和中等危害的食物传播性病原菌。有研究表明，当沙门氏菌的污染量超过105CFU时即可引起健康人体感染。而对于老人、儿童等免疫力低下及易感人群而言，污染量仅为15
‑
20CFU就可引起严重感染。因此，尽早预防和尽快检测沙门氏菌至关重要。
[0004]沙门氏菌属于肠杆菌科，是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，其菌体呈两端钝圆的棒状，大小约为(2
‑
5μm)
×
(0.7
‑
1.5μm)，其在培养基中菌落呈无色半透明圆形状，且表面光滑、边缘平整。沙门氏菌的生长温度范围较广(10℃
‑
42℃)，当温度超过20℃时即能大量繁殖，其中37℃为其最适生长温度。沙门氏菌的环境适应性较强，虽然6.8
‑
7.8是沙门氏菌的最适pH，但其在4.5
‑
9.5的pH范围内也可生长，并且在低水活度的条件下(水活度Aw<0.2)仍可长期生存。此外，因为沙门氏菌的培养无需丰富的营养，所以即使是在普通培养基上其也能生长。
[0005]抗体存在制备和储存困难等问题，且还可能与不同抗原出现交叉反应。核酸适配体作为一种稳定特异的识别元件，不仅能够特异性识别目标物质，而且还易于多种分子偶联，并与多种信号传导模式相容。因此，开发一种基于核酸适配体的生物传感器对实现快速、灵敏地检测食源性致病菌有着重要意义。
[0006]目前，对沙门氏菌的检测方法主要有传统培养法、分子生物学方法以及免疫学方法，如聚合酶链式扩增反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫磁珠分离法(IMS)等。传统培养法检测容易受到食品基质的干扰、周期长且操作过程繁琐，无法满足对于致病菌快速、简单和灵敏检测的要求，因此迫切需要一种操作简单、快速和准确的检测技术。分子生物学方法，例如主流的PCR技术，虽然相对于传统培养方法，PCR技术很大程度的缩短了检测的时间，并且能够实现高灵敏度的检测，然而却需要复杂的核酸提取程序，而且由于死细胞也具有DNA，因此可能会高估活细胞的数量。与PCR方法相比，LAMP减少了对高度复杂设备的需求，并且成本低，反应时间短。但LAMP由于灵敏度过高，可能在环境中产生气溶胶而无法消除，导致结果出现假阳性结果，而且仍然需要核酸提取操作。免疫学方法易环境因素影响、检测成本高、抗体亲和力低等缺点也限制了其应用。免疫学方法存在的问题限制了ELISA、IMS等技术的应用。但是，IMS的磁分离特性具有减少预富
集时间、降低食品基质干扰等优点。因此，迫切需要将IMS技术与其他检测技术的联合应用以开发一种简单、经济、快速、灵敏的致病菌检测分析系统。
[0007]荧光适体传感器是最常见的光学检测方法，主要是基于与目标物结合后荧光信号的产生或猝灭，通过检测荧光强度的信号变化进行分析。由于该方法具有高灵敏度、高检测效率以及操作简单等特性，已被广泛应用于食源性致病菌的检测中。常用的有机荧光染料具有光稳定性差、低吸收、宽发射和光漂白特性等缺点。量子点材料相比于有机荧光染料具有很多优点，但是大多含有重金属，其生物毒性限制了其应用与发展。因此，开发出一种具有更稳定光学特性及低毒的荧光标记物对于应用荧光适体传感器检测食源性致病菌是十分有必要的。

技术实现思路

[0008]为了解决利用传统微生物学方法、分子生物学方法以及免疫学方法检测沙门氏菌中存在的问题，本专利技术提供了一种快速检测沙门氏菌的适体生物传感器，包括由SMBs
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cDNA2复合物、适配体Apt2和AuNPs
‑
cDNA3探针建立的夹心结构SMBs
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Apt2
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AuNPs，和被用作荧光信号的以DNA为模板合成的银纳米簇DNA
‑
AgNCs；所述SMBs
‑
cDNA2复合物由链霉亲和素磁珠与生物素修饰的核酸链cDNA2连接，cDNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AuNPs
‑
cDNA3探针由AuNPs溶液与巯基修饰的cDNA3制备而成，cDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；所述适配体Apt2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0009]在没有沙门氏菌的情况下，SMBs
‑
Apt2
‑
AuNPs系统保持完整性，当加入DNA
‑
AgNCs时，系统中的AuNPs与AgNCs发生荧光共振能量转移以猝灭AgNCs的荧光；在有沙门氏菌的情况下，在上清液中悬浮的AuNPs
‑
cDNA3探针和结合Apt2的沙门氏菌通过磁分离被去除，从而导致荧光不被猝灭。
[0010]本专利技术还提供了上述适体生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0011](1)制备SMBs
‑
cDNA2复合物：SMBs经1
×
B&W缓冲液洗涤后，重悬于2
×
B&W缓冲液中，加入等体积的cDNA2溶液孵育，去除上清，经1
×
B&W缓冲液洗涤后，重悬于PBS溶液中，得到SMBs
‑
cDNA2复合物；
[0012](2)制备AuNPs
‑
cDNA3探针：将巯基修饰的cDNA3与AuNPs溶液混合，孵育后加入磷酸缓冲液A，再次进行孵育，分多次缓慢加入含有2mol/L NaCl的磷酸缓冲液B进行老化，直至溶液中NaCl浓度达到0.01mol/L～2mol/L，离心后用去离子水重悬获得AuNP
‑
cDNA3探针；
[0013](3)制备SMBs
‑
Apt2
‑
AuNPs系统及合成DNA
‑
AgNCs：将Apt2、SMBs
‑
cDNA2复合物和AuNPs
‑
cDNA3探针在PBS溶液中混合并进行孵育，磁分离去除上清，再用PBS溶液洗涤三次获得SMBs
‑
Apt2
‑
AuNPs系统；向含有DNA模板的PB溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测沙门氏菌的适体生物传感器，其特征在于，包括由SMBs
‑
cDNA2复合物、适配体Apt2和AuNPs
‑
cDNA3探针建立的夹心结构SMBs
‑
Apt2
‑
AuNPs，和被用作荧光信号的以DNA为模板合成的银纳米簇DNA
‑
AgNCs；所述SMBs
‑
cDNA2复合物由链霉亲和素磁珠与生物素修饰的核酸链cDNA2连接，cDNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AuNPs
‑
cDNA3探针由AuNPs溶液与巯基修饰的cDNA3制备而成，cDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；所述适配体Apt2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；在没有沙门氏菌的情况下，SMBs
‑
Apt2
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AuNPs系统保持完整性，当加入DNA
‑
AgNCs时，系统中的AuNPs与AgNCs发生荧光共振能量转移以猝灭AgNCs的荧光；在有沙门氏菌的情况下，在上清液中悬浮的AuNPs
‑
cDNA3探针和结合Apt2的沙门氏菌通过磁分离被去除，从而导致荧光不被猝灭。2.权利要求1所述适体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备SMBs
‑
cDNA2复合物：SMBs经1
×
B&W缓冲液洗涤后，重悬于2
×
B&W缓冲液中，加入等体积的cDNA2溶液孵育，去除上清，经1
×
B&W缓冲液洗涤后，重悬于PBS溶液中，得到SMBs
‑
cDNA2复合物；(2)制备AuNPs
‑
cDNA3探针：将巯基修饰的cDNA3与AuNPs溶液混合，孵育后加入磷酸缓冲液A，再次进行孵育，分多次缓慢加入含有2mol/LNaCl的磷酸缓冲液B进行老化，直至溶液中NaCl浓度达到0.01mol/L～2mol/L，离心后用去离子水重悬获得AuNP
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cDNA3探针；(3)制备SMBs
‑
Apt2
‑
AuNPs系统及合成DNA
‑
AgNCs：将Apt2、SMBs
‑
cDNA2复合物和AuNPs
‑
cDNA3探针在PBS溶液中混合并进行孵育，磁分离去除上清，再用PBS溶液洗涤三次获得SMBs
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Apt2
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AuNPs系统；向含有DNA模板的PB溶液中加入AgNO3溶液，于黑暗中进行孵育，加入NaBH4剧烈震荡，使用前避光稳定，以使用的DNA浓度即为制备的DNA
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AgNCs的浓度。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述SMBs的用量为0.1
‑
5mg，2
×
B&W缓冲液的用量为20
‑
500μL，PBS溶液的用量为20
‑
500μL，所述cDNA2的浓度为0.5
‑
5μmol/L；所述孵育温度为25
‑
45℃，孵育时间为30
‑
120min；所述最终得到的SMBs
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cDNA2复合物的终浓度为1
‑
20μg/μL。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，满朝新，杨鑫焱，庞立冬，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：