检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法及装置，该方法包括：于产微囊藻毒素的蓝藻培养液中加入不同浓度的钙离子和镁离子进行培养；取不同浓度的钙离子和镁离子培养的蓝藻培养液，收集藻细胞，进而检测出待测样品中的微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数；取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集上清液，检测其中微囊藻毒素的含量；对上述两步骤的结果进行相关性分析，建立不同浓度钙离子和镁离子培养的蓝藻中藻毒素产生量与mcyD的基因拷贝数的关系；利用藻毒素产生量与mcyD的基因拷贝数的关系，通过测定mcyD的基因拷贝数来确定不同培养条件下微囊藻毒素的生成量。

Method and device for detecting the effect of calcium ion and magnesium ion on the formation of Microcystin

The invention discloses a method and a device for detecting effect of calcium and magnesium ions on microcystin production, the method includes: in the production of microcystin algae cultivation of calcium and magnesium ions with different concentrations of liquid in the liquid culture; from sub cultured cyanobacteria were cultured with different concentrations of calcium and magnesium collect, algae cell, and detect the analyte in a sample copy of microcystin toxin producing gene mcyD gene; calcium and magnesium ions were cultured with different concentrations of microcystin producing cyanobacteria cultured supernatant was collected to examine the content of Microcystis toxin; on the two steps of the the correlation analysis, the relationship between the copy number of the establishment of microcystins in different concentrations of calcium and magnesium ions in cyanobacterial production and mcyD gene; copy output and mcyD using algae toxin gene number The relationship was determined by determining the gene copy number of mcyD to determine the production of microcystins under different culture conditions.

【技术实现步骤摘要】
检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法及装置
本专利技术涉及一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法及装置，特别是涉及一种藻毒素产毒基因检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法及装置。
技术介绍
铜绿微囊藻是水体中最为常见的蓝藻，它是水体中的初级生产者，在水环境中发挥着重要的作用。铜绿微囊藻可以产生微囊藻毒素(microcystin，MC)，它是一种环状的寡肽肝毒素，在全世界很多国家的天然水体中都能检测到微囊藻毒素。MC影响浮游植物、无脊椎动物和脊椎动物的生长。MC可以导致水体内细菌、原生动物和其他浮游植物(包括硅藻和绿藻)中毒，抑制它们生长繁殖，改变食物链结构，使得铜绿微囊藻成为优势藻种。MC不仅对水体中其他生物具有危害作用，而且还对湖泊、河流生态、牲畜和人类水源供给带来负面影响。Amé等研究SanRoque水库中蓝藻水华的发生情况，检测了水体中28个物理化学指标，通过对它们进行差异分析，发现温度、碳酸盐、氨氮、硝态氮和镁等是最重要的参数，通过这些参数可以分辨出蓝藻群体含有MC的高低。有研究发现，当钙离子浓度低于20mg/L时，藻细胞以单个形式存在，但是当钙离子浓度高于20mg/L时，藻细胞以群体形式存在。群体形成增加，一方面有效阻止了浮游动物的摄食，提高了微囊藻群体的存活率，另一方面有助于微囊藻的垂直迁移，以便获得更充足的光照和营养。细胞外脂多糖影响微囊藻细胞粘性，有助于一些藻细胞的聚集。目前为止，很少有人研究钙离子和镁离子对铜绿微囊藻生长和藻毒素分泌产生的影响，因此，很有必要提出一种技术手段，以研究钙离子和镁离子对铜绿微囊藻生长和藻毒素分泌产生的影响。MC由微囊藻毒素基因簇(microcystinsynthetasegeneclusters，mcy)编码生成，基因簇位于染色体上，包含由10个基因组成的两个方向相反的操纵子。其中mcyD基因参与编码合成MC的Adda，而Adda与MC的毒性密切相关。因此可以通过检测mcyD基因的拷贝数来检测藻毒素的产生，因而，本专利技术提出利用藻毒素合成酶基因研究钙离子和镁离子对藻毒素生成产生的影响。
技术实现思路
为克服上述现有技术存在的不足，本专利技术之目的在于提供一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法及装置，以通过往培养液中加入不同浓度的钙离子和镁离子，检测微囊藻毒素的含量和微囊藻毒素产毒基因mcyD的拷贝数，建立一种通过检测藻毒素合成酶基因mcyD拷贝数来研究钙离子、镁离子对藻毒素生成产生影响的方法，大大简化藻毒素的测定过程，节省大量的人力和时间。为达上述及其它目的，本专利技术提出一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法，包括如下步骤：步骤一，于产微囊藻毒素的蓝藻培养液中加入不同浓度的钙离子和镁离子进行培养；步骤二，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集藻细胞，进而检测出待测样品中的微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数；步骤三，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集上清液，检测其中微囊藻毒素的含量；步骤四，对步骤二和步骤三的结果进行相关性分析，建立不同浓度钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻中藻毒素产生量与微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数的关系；步骤五，利用藻毒素产生量与微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数的关系，通过测定微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数来确定不同培养条件下微囊藻毒素的生成量。进一步地，步骤二包括：步骤S1，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的铜绿微囊藻培养液，去掉上清液，收集藻细胞；步骤S2，将藻细胞转移至离心管中，洗涤后再次离心并去掉上清液，收集藻细胞；步骤S3，对步骤S2中的藻细胞进行细胞内总RNA的提取；步骤S4，进行RNA的反转录，合成cDNA；步骤S5，以步骤S4中的cDNA为模板进行PCR扩增；步骤S6，对PCR扩增产物进行纯化；步骤S7，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；步骤S8，利用步骤S7中的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，进行梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；步骤S9，将步骤S4中获得的cDNA样品作为待测样品替代步骤S8中的标准样品，进行定量PCR的测定，根据标准曲线确定待测样品中的DNA浓度，并检测出待测样品中的微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数。进一步地，于步骤S1中，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的m1毫升铜绿微囊藻培养液，用t转/分钟离心n分钟，去掉上清液。进一步地，于步骤S2中，利用磷酸缓冲盐溶液将藻细胞转移至m2毫升离心管中，采用低温离心去掉上清液，收集藻细胞，并将藻细胞进行低温或液氮保存，用于后续操作。进一步地，于步骤S3中，利用RNA提取试剂盒对步骤S2中的藻细胞进行细胞内总RNA的提取。进一步地，于步骤S5中，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL，引物信息如下：上游引物序列为5’-GCCCACAAAACCCCAACTC-3’(SEQIDNO.1)、下游引物序列为5’-TTTCTGCCTAATCTTTTCCCCTCT-3’(SEQIDNO.2)，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃30秒，退火温度60℃40秒和72℃延伸40秒，进行30个循环，最终72℃延伸10分钟，通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。进一步地，于步骤S9中，加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品，进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒；PCR反应，40个循环，95℃5秒，60℃30秒。进一步地，步骤三包括：取m3毫升藻细胞培养液，进行低温离心，收集上清液，用于测定培养液中微囊藻毒素含量；用磷酸缓冲盐缓冲液将藻细胞转移至m2毫升离心管中，进行低温离心，洗涤一次；利用磷酸缓冲盐缓冲液悬浮沉淀的藻细胞，液氮反复冻融若干次，进行低温离心，收集上清液，用于测定铜绿微囊藻细胞内微囊藻毒素含量；将获得的每个样品设置三个平行样，按照酶联免疫试剂盒操作说明测定培养液中微囊藻毒素含量和铜绿微囊藻细胞内微囊藻毒素含量。进一步地，在测定微囊藻毒素含量前，进行预实验，以确定样品的稀释倍数，使得微囊藻毒素测定值在试剂盒检测范围内，最后计算时乘以稀释倍数，即可算出样品中实际的微囊藻毒素含量。为达到上述目的，本专利技术还提供一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的装置，包括：培养液培养单元，于产微囊藻毒素的蓝藻培养液中加入不同浓度的钙离子和镁离子进行培养；mcyD拷贝数检测单元，用于取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集藻细胞，进而检测出待测样品中的微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数；藻毒素含量检测单元，用于取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集上清液，检测其中微囊藻毒素的含量；相关性分析单元，对所述mcyD拷贝数检测单元和藻毒素含量检测单元的结果进行相关性分析，建立不同浓度钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻中藻毒素产生量与微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数的关系；藻毒素生成量确定单元，利用藻毒素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法，包括如下步骤：步骤一，于产微囊藻毒素的蓝藻培养液中加入不同浓度的钙离子和镁离子进行培养；步骤二，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集藻细胞，进而检测出待测样品中的微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数；步骤三，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集上清液，检测其中微囊藻毒素的含量；步骤四，对步骤二和步骤三的结果进行相关性分析，建立不同浓度钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻中藻毒素产生量与微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数的关系；步骤五，利用藻毒素产生量与微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数的关系，通过测定微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数来确定不同培养条件下微囊藻毒素的生成量。

【技术特征摘要】
2017.08.02 CN 20171065242541.一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法，包括如下步骤：步骤一，于产微囊藻毒素的蓝藻培养液中加入不同浓度的钙离子和镁离子进行培养；步骤二，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集藻细胞，进而检测出待测样品中的微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数；步骤三，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻培养液，收集上清液，检测其中微囊藻毒素的含量；步骤四，对步骤二和步骤三的结果进行相关性分析，建立不同浓度钙离子和镁离子培养的产微囊藻毒素的蓝藻中藻毒素产生量与微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数的关系；步骤五，利用藻毒素产生量与微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数的关系，通过测定微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数来确定不同培养条件下微囊藻毒素的生成量。2.如权利要求1所述的一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法，其特征在于，步骤二进一步包括：步骤S1，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的铜绿微囊藻培养液，去掉上清液，收集藻细胞；步骤S2，将藻细胞转移至离心管中，洗涤后再次离心并去掉上清液，收集藻细胞；步骤S3，对步骤S2中的藻细胞进行细胞内总RNA的提取；步骤S4，进行RNA的反转录，合成cDNA；步骤S5，以步骤S4中的cDNA为模板进行PCR扩增；步骤S6，对PCR扩增产物进行纯化；步骤S7，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；步骤S8，利用步骤S7中的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，进行梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；步骤S9，将步骤S4中获得的cDNA样品作为待测样品替代步骤S8中的标准样品，进行定量PCR的测定，根据标准曲线确定待测样品中的DNA浓度，并检测出待测样品中的微囊藻毒素产毒基因mcyD的基因拷贝数。3.如权利要求2所述的一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法，其特征在于：于步骤S1中，取不同浓度的钙离子和镁离子培养的m1毫升铜绿微囊藻培养液，采用低温离心，去掉上清液。4.如权利要求2所述的一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法，其特征在于：于步骤S2中，利用磷酸缓冲盐溶液将藻细胞转移至m2毫升离心管中，采用低温离心去掉上清液，收集藻细胞，并将藻细胞进行低温或液氮保存，用于后续操作。5.如权利要求4所述的一种检测钙离子和镁离子对微囊藻毒素生成影响的方法，其特征在于：于步骤S3中，利用RNA提取试剂盒对步骤S2中的藻细胞进行细胞内总RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，何义亮，姜蕾，张东，舒诗湖，王铮，马艳，
申请(专利权)人：上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司，上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31