一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒，包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：PSA抗体、CD45抗体和PSMA抗体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。本发明专利技术的试剂盒可以有效的富集目标细胞，并且确认富集的目标细胞是否来源于前列腺癌的早期患者，并对CTC进行分型。同时，本发明专利技术通过双瘤标检测增加肿瘤检测灵敏度并且进一步通过CEP8的检测保证检测的准确性。此外，本发明专利技术通过染色增强液加强染色效果，使多种带荧光染色标记的抗体都可以与目标细胞结合，对目标细胞染色，染色效果更好，荧光更强，而且边界清晰。

【技术实现步骤摘要】
一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒
本专利技术涉及液体活检领域，具体地说是一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒。
技术介绍
前列腺癌列中国男性恶性肿瘤发病率的第6位，2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万。前列腺癌发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁。家族遗传型前列腺癌患者发病年龄稍早，年龄≤55岁的患者占43％。目前，针对前列腺癌的早期筛查，基于液体活检检测循环肿瘤细胞(CTC)的方法具有众多传统检测方法所没有的优势，包括无创、快捷、准确率高等优点。CTC是一种自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC被视为转移的种子，在新的肿瘤生物标志物的发现、肿瘤预后判断及个体化治疗方面存在很大的应用潜力，是国内外肿瘤研究的热点之一。然而现有的CTC检测的应用主要在检测癌症转移复发上，对于癌症的早期检测研究较少。其实，CTC在癌症的早期检测中也具有重要价值，研究表明肿瘤在1mm时，血液中即可检出CTC，通过检测外周血循环中CTC的存在，可以在癌症的早期发现癌症。为此，有效的CTC捕获富集分析方法对于基于CTC的早筛很重要。目前为止，基于EpCAM的CTC捕获富集分析平台仍然被作为转移肿瘤中CTC检测的金标准，但是该方法是否适合用于肿瘤的早期检测仍存在争议，而且前列腺癌患者的CTC往往表现出非上皮的特征，以广谱的上皮粘附分子EpCAM为生物标志物对于前列腺癌的CTC的检测存在很高的假阴性，同时该标志物不具有组织特异性，无法追溯CTC的具体组织来源，而这一点对于后续的肿瘤治疗具有重要意义。因此，发现并应用一些前列腺癌组织特异性的生物标志物进行CTC的检测分析显得尤为重要。公告日为2014年1月15日，公告号为CN102313813B的中国专利中公开了一种通过免疫荧光染色对稀有细胞进行检测的方法，该方法对白细胞、稀有细胞和细胞核进行三色染色，再通过荧光检测。但是该方法仅能通过一种单抗来特异性识别该稀有细胞，容易造成漏检。同时，由于细胞的异质性，每个细胞表达的抗原(抗体)量不一，导致有时荧光强度非常微弱，在荧光显微镜下难以分辨。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒，利用该试剂盒可以检测外周血中CTC的数量，判断该CTC是否来源于前列腺癌，区分检出的早期前列腺癌CTC的类型，而且检测结果准确，误差小。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒，所述试剂盒包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：PSA抗体、CD45抗体和PSMA抗体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。所述染色增强液的溶剂为生物缓冲液。优选的，所述表面活性剂选自TritonX-100、二甲基亚砜、NP-40、十二烷基硫酸钠(SDS)中的任一种。更优选的，所述表面活性剂为TritonX-100或SDS。最优选的，所述染色增强液包括浓度为0.01～1mg/mL的SDS，染色增强液的溶剂为常用的生物缓冲液，如PBS缓冲液等。优选的，所述试剂盒中还包括淋巴细胞分离液和用于去除白细胞的免疫磁珠。淋巴细胞分离液和免疫磁珠能够用于去除红细胞和白细胞的干扰，便于更好的富集CTC。更优选的，所述用于去除白细胞的免疫磁珠为表面偶联有抗体CD45、CD14和CD15的免疫磁珠中的一种或多种，最优选包括全部的上述免疫磁珠。优选的，所述特异性抗体PSA抗体、CD45抗体和PSMA抗体的荧光染色标记具有各自不同的发射波长。根据本领域技术人员公知的，为了区分不同的特异性抗体，本专利技术应当采用不同的荧光染色标记。标记染料可以采用本领域任何常用的荧光染料，只要通过调节激发光波长可区分即可。由于荧光染色标记的发射波长各自不同，因此通过荧光显微镜在不同的滤光片下可以完全区分开。本专利技术优选采用的荧光染色标记为AlexaFluor系列分子、花青染料。更优选为Alexa594、CY5和Alexa488，其中Alexa594发射波长为618nm，CY5发射波长为670nm，Alexa488发射波长为519nm。其中，带荧光染色标记的CD45抗体优选为CD45-Alexa594(红色)、带荧光染色标记的PSA抗体可以为PSA-Alexa488(绿色)或PSA-CY5(肉眼不可见，显微镜扫描赋以紫色)、带荧光染色标记的PSMA抗体为PSMA-CY5(肉眼不可见，显微镜扫描赋以紫色)或PSMA-Alexa488(绿色)。所述用于荧光原位杂交的荧光探针可以为用于染色体荧光原位杂交的探针，如CEP8荧光探针。优选的，所述染色增强液中还包括占染色增强液质量百分含量0.1～3％的聚乙二醇。聚乙二醇与表面活性剂配合可以进一步加强染色液的染色效果。作为本领域技术人员公知的，将带荧光染色标记的特异性抗体与细胞进行孵育从而进行荧光染色的过程可以为液体染色或固体染色。如果进行液体染色则先将需要进行细胞染色的细胞重悬成细胞悬液，然后依次进行染色预处理、细胞染色，再将细胞转移到载玻片上进行细胞固定、载玻片封片。而如果在载玻片上进行固体染色，则先将细胞在载玻片上进行细胞固定，然后依次进行染色预处理、细胞染色后，再对载玻片封片。上述细胞固定是通过细胞固定液进行的，所述细胞固定液可以为本领域常用的细胞固定液，例如多聚甲醛、戊二醛、福尔马林、乙醇、丙酮中的一种或几种的组合。一种利用上述基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒进行CTC检测的方法包括以下步骤：富集外周血中的目标细胞；利用染色增强液对目标细胞进行增强染色预处理；利用带荧光染色标记的特异性抗体对目标细胞进行荧光染色；目标细胞固定；用荧光探针进行荧光原位杂交；DAPI封片及镜检。经过增强染色预处理之后的目标细胞，特异性抗体与目标细胞的结合更好，荧光染色更明显，细胞膜边界清晰。作为本领域技术人员公知的，当肿瘤细胞特异性抗原存在于细胞内时，应当对细胞膜表面染色并固定目标细胞后，再将细胞膜破膜并利用带荧光染色标记的特异性抗体对目标细胞进行细胞内荧光染色。其中，所述富集外周血中的目标细胞包括以下步骤：(1)将外周血离心分离血浆和血细胞，并去除血浆；(2)向步骤(1)中加入细胞缓冲液和淋巴细胞分离液离心分层，去除红细胞层；(3)向步骤(2)中加入用于去除白细胞的免疫磁珠并孵育得到悬浊液；(4)将步骤(3)中的悬浊液磁分离去除白细胞以及剩余的红细胞，再洗涤后得到富集后的目标细胞。所述的淋巴细胞分离液可以为本领域常用的淋巴细胞分离液，用于根据密度分离红细胞即可，本专利技术优选的采用Ficoll分离液。本专利技术对目标细胞的富集包括两次去除红细胞，可以对红细胞去除更加干净，而且通过淋巴细胞分离液和免疫磁珠，可以一次性去除白细胞和剩余红细胞，富集效率更高。经过上述富集处理后能够排除其他细胞对于荧光染色的干扰，有利于通过荧光显微镜进行更好的观察。优选的，所述利用染色增强液对目标细胞进行增强染色预处理的处理时间为5～10分钟。染色增强液加入后表面活性剂的终浓度为0.2μg/mL～1mg/mL。其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：PSA抗体、CD45抗体和PSMA抗体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。

【技术特征摘要】
1.一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：PSA抗体、CD45抗体和PSMA抗体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。2.根据权利要求1所述的基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒，其特征在于：所述染色增强液的溶剂为生物缓冲液。3.根据权利要求1所述的基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂选自TritonX-100、二甲基亚砜、NP-40、十二烷基硫酸钠中的任一种。4.根据权利要求1所述的基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括淋巴细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：张培培，陈昌岳，段彪，张祥林，李静，蔡红东，冯丽娜，
申请(专利权)人：上海美吉医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31