水稻抗褐飞虱基因BPH9基因内特异SNP共显性分子标记引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻抗褐飞虱基因BPH9内特异SNP共显性分子标记引物，属于植物分子育种领域。本标记引物及其序列分别为：BPH9‑IF:ACCATTGTTAGGCAGTTGTTCA；BPH9‑ER:ATTCGACTCCCTTTCTTGTTATCT；BPH9‑IR:CAGCCTCCTGAAGAGATCTTTCA；BPH9‑EF:AATGTCGCACCCAGCAGC。本发明专利技术利用该引物对水稻DNA样本进行PCR扩增，可快速判断待测水稻BPH9的基因型，方法简便快捷、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源BPH9基因型的鉴定。

Specific primers and applications of specific SNP co dominant molecular markers in rice resistance to the brown planthopper gene BPH9 gene

The invention discloses a specific SNP co dominant molecular marker primer in rice resistant to the brown planthopper gene BPH9, which belongs to the field of plant molecular breeding. The primers and sequences were: BPH9 IF:ACCATTGTTAGGCAGTTGTTCA BPH9; ER:ATTCGACTCCCTTTCTTGTTATCT BPH9; IR:CAGCCTCCTGAAGAGATCTTTCA BPH9 EF:AATGTCGCACCCAGCAGC. The invention can be used for PCR amplification of rice DNA samples, which can quickly determine the genotype of rice BPH9. The method is simple, fast and inexpensive, and can be widely applied to marker assisted selection breeding or BPH9 genotype identification of rice germplasm.

【技术实现步骤摘要】
水稻抗褐飞虱基因BPH9基因内特异SNP共显性分子标记引物及应用
本专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗稻飞虱基因BPH9基因内特异SNP共显性分子标记引物与应用，本专利技术提供的分子标记引物适于在水稻育种中对BPH9基因型的大量筛选以及从水稻种质资源中筛选新的BPH9基因型抗性亲本。
技术介绍
随着生物技术的发展，人类进入后基因组时代，全面开展功能基因组研究已成为生命科学研究的前沿领域。目前，水稻基因组精细遗传图谱和物理图谱已经完成，进一步对水稻功能基因进行研究，对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。水稻是我国重要的粮食作物，褐飞虱是我国稻区最为严重的虫害之一，严重影响稻谷的产量和质量。利用抗虫基因培育抗虫水稻品种是控制水稻褐飞虱最为经济有效的方式。由于水稻抗褐飞虱抗性鉴定复杂，利用常规手段选育抗虫品种往往需要较大的投入、以及难以有效的导入和聚合不同的抗虫基因。因此，利用分子标记辅助选择、聚合具有不同抗谱的抗虫基因，培育广谱、持久抗虫品种是解决水稻褐飞虱虫害的最佳途径。水稻抗褐飞虱基因BPH9位于水稻12号染色体，其供体亲本来源Pokkali，是一个对褐飞虱多个生物型具有广谱抗性的品种，因此通过开发BPH9特异性分子标记，利用分子标记辅助选择将BPH9抗性等位基因导入栽培稻品种，对培育具有褐飞虱抗性的水稻品种具有重要意义。目前分子标记辅助选择育种中，对BPH9基因的选择主要利用与之连锁的标记，如RM28483、InD28450、InD28453、InD284323、InD2、InD14、RM28466、RM28481、RM2848等，而基因标记还未见报道，这在一定程度上影响了BPH9在水稻抗褐飞虱育种中选择的效率和准确性。两对交叉引物PCR(PCRwithconfrontingtwo-pairprimers，PCR-CTPP)是一种操作简便、分型快速、费用低廉的SNP分型方法，该方法通过一次PCR反应和常规电泳技术即可区分3种不同基因型，其基本原理为：引物3’存在错配时，延伸效率会降低，扩增受阻。基于此原理，以SNP位点分别为正反引物的3’设计两条特异性引物，并分别在SNP位点的上下游设计两条外引物，根据两对引物的扩增片段大小和数量鉴定SNP的类型。本专利技术在PCR-CTPP方法基础上加以改进，BPH9基因的第一个外显子的第725和726碱基处存在两个连续的SNP位点，其中BPH9抗性基因为5’-CA-3’，其余等位基因为5’-TG-3’，以该两个SNP位点分别为正反两条特异性内引物3’的第一和第二位碱基进行引物设计，并在3’端第3位碱基引入错配，增加引物的特异性开发一套利用PCR电泳便可区分BPH9基因3种不同基因型的特异性分子标记，通过设计4条引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增带型判断BPH9基因型。具有纯合抗性BPH9等位基因的材料扩增出230bp特异性条带；具有其他纯合BPH9等位基因的材料扩增出316bp特异性条带；杂合等位基因扩增出230bp、316bp条带，3种基因型均可扩增出503bp的非特异性条带。因此，利用一次PCR扩增就可将3种不同基因型材料区分，该方法简单可控、成本低廉，适于田间大量材料的基因型鉴定，提高育种效率。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供了水稻抗褐飞虱基因BPH9基因内特异SNP共显性分子标记引物，分别为：BPH9-IF:ACCATTGTTAGGCAGTTGTTCA；BPH9-EF:AATGTCGCACCCAGCAGC。BPH9-ER:ATTCGACTCCCTTTCTTGTTATCT；BPH9-IR:CAGCCTCCTGAAGAGATCTTTCA，引物特异性好，扩增效率高，可用于水稻抗褐飞虱基因BPH9的基因型鉴定。本专利技术的另一个目的是提供了水稻抗褐飞虱基因BPH9特异SNP共显性分子标记引物的应用方法，利用该引物可以有效地对抗褐飞虱基因BPH9进行基因型选择，既可以用于水稻资源的筛选鉴定，又可以用于水稻抗褐飞虱基因BPH9的分子标记辅助育种。为达到上述目的，本专利技术的技术方案为：水稻抗褐飞虱基因BPH9基因内特异SNP共显性分子标记，其引物序列分别为：BPH9-IF:ACCATTGTTAGGCAGTTGTTCA；BPH9-ER:ATTCGACTCCCTTTCTTGTTATCT；BPH9-IR:CAGCCTCCTGAAGAGATCTTTCA；BPH9-EF:AATGTCGCACCCAGCAGC；引物设计原理如下(图1)：首先在BHP9第一外显子725与726位目标SNP位点CA/TG处以BPH9特异序列5’-CA-3为引物的3’端设计特异性扩增BPH9抗性等位的正向内引物IF,并在3’第3位碱基处引入T/T错配增加引物的特异性，再设计一条与IF配对的反向外引物ER，由于IF的3’端与BPH9其他等位基因对应的序列5’-TG-3’无法配对结合，因此只能特异性扩增BPH9抗性等位基因材料，获得230bp的片段；同理，按照上述思路，以与5’-TG-3’互补配对的5’-CA-3’作为反向内引物的3’端，同样在3’第3位碱基处引入T/T错配增加引物的特异性，再设计与IR配对的正向外引物EF，同理该对引物只能扩增BPH9其他等位基因材料，产生316bp带型；两对引物等量混合扩增便可实现对水稻BPH9基因型的鉴定，并且两种基因型均有一条503bp的条带。此外，该标记为共显性标记，杂合基因型将扩增出230bp、316bp和503bp的3种带型。4条引物的名称、序列、Tm值及扩增产物长度具体见表1。水稻抗褐飞虱基因BPH9特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：1)水稻DNA的提取2)合成表1所示引物序列3)PCR扩增PCR体系以10ul记为：1ul10×PCR反应缓冲液，0.8ul10mMdNTP，4条引物均为0.15ul10uM引物，0.1ulTaqDNA聚合酶；2ulDNA模板，双蒸水补足余量。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。4)结果判定根据扩增条带类型判断基因型，含有纯合抗性BPH9等位基因类型的水稻品种扩增出230bp和503bp条带，其他纯合等位型扩增出316bp和503bp条带，杂合型品种扩增出230bp、316bp和503bp条带。表1：引物名称序列5'-3'Tm值(℃)扩增产物产物长度(bp)BPH9-IFACCATTGTTAGGCAGTTGTTCA58BPH9-IRCAGCCTCCTGAAGAGATCTTTCA58INT6R/EXT6F(TG)型316bpBPH9-ERATTCGACTCCCTTTCTTGTTATCT60INT6F/EXT6R(CA)型230bpBPH9-EFAATGTCGCACCCAGCAGC60EXT6F/EXT6R(共有带型)503bpBPH9基因位于水稻12号染色体，包含3个外显子编码1206个氨基酸，通过对BPH9不同等位基因间的测序及数据库序列比对(序列来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，发现BPH9不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻抗褐飞虱基因BPH9内特异SNP共显性分子标记引物，其特征在于，序列包括：BPH9‑IF:ACCATTGTTAGGCAGTTGTTCABPH9‑ER:ATTCGACTCCCTTTCTTGTTATCTBPH9‑IR:CAGCCTCCTGAAGAGATCTTTCABPH9‑EF:AATGTCGCACCCAGCAGC。

【技术特征摘要】
1.一种水稻抗褐飞虱基因BPH9内特异SNP共显性分子标记引物，其特征在于，序列包括：BPH9-IF:ACCATTGTTAGGCAGTTGTTCABPH9-ER:ATTCGACTCCCTTTCTTGTTATCTBPH9-IR:CAGCCTCCTGAAGAGATCTTTCABPH9-EF:AATGTCGCACCCAGCAGC。2.利用权利要求1所述标记引物的序列对水稻抗褐飞虱基因BPH9的鉴定方法，其特征在于：对水稻DNA进行PCR扩增：纯合BPH9基因型扩增出230bp特异性条带和506bp非特异性条带，其余等位基因类型扩增出316bp特异性条带和506bp非特异性条带，杂合基因型扩增出230bp、316bp和506bp条带。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨远柱，邓钊，何光存，陈荣智，王凯，秦鹏，符辰建，刘开雨，
申请(专利权)人：湖南隆平高科种业科学研究院有限公司，武汉大学，袁隆平农业高科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43