用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法。该方法利用多探针靶向捕获技术结合二代测序技术，用于富集和检测实体瘤中76个基因的变异情况，如突变，缺失，插入，融合，拷贝数变化，从而准确快速达到检测用于实体瘤用药指导的基因变异的目的。

【技术实现步骤摘要】
用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种基于多探针富集多基因用于高通量测序的方法，运用此方法可以为实体瘤患者提供用于用药指导的分子水平的信息，辅助医生的精准治疗。
技术介绍
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。因此，从本质上来说肿瘤是一种基因病。二代测序(Next-generationsequencing，NGS)，也称为高通量测序，能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，可同步获得肿瘤患者个体特定样本中数以十亿计的DNA碱基序列信息，是发现已知和未知疾病相关基因变异的高效手段。因此，利用二代测序技术从基因水平上了解肿瘤患者其序列或结构的异常更有利于精准治疗。2016年4月23日，中国临床肿瘤学会(CSCO)、中国肿瘤驱动基因分析联盟(CAGC)在北京发布《二代测序(NGS)技术应用于临床肿瘤精准诊治的共识》，以及后续《实验室自建分子诊断项目基本要求专家共识》、《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》的出台给NGS用于临床肿瘤基因检测提供了公认的指导规范。基因检测作为肿瘤精准治疗的基础，为临床用药提供了科学的依据。2016年12月19日，美国食品和药物管理局(FDA)批准了FoundationMedicine公司的FoundationFocusCDxBRCA产品，成为市场上第一个基于二代测序的伴随诊断试剂盒。该产品是基于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的卵巢肿瘤组织，采用NGS技术检测BRCA1和BRCA2的突变。如果患者具有BRCA1/2有害突变的阳性结果，更易对ClovisOncology公司生产的PARP抑制剂Rubraca(rucaparib)有反应，从而接受Rubraca治疗。实体瘤是当前癌症治疗中最具挑战的一类肿瘤，占据癌症约80％，源自上皮组织的实体瘤包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和卵巢癌等。近年来利用二代测序技术的研究表明同一肿瘤类型，基因变异类型也可能不完全一致；不同肿瘤类型，基因变异类型也可能一致，因此从分子层面对肿瘤进行分型是实现肿瘤精准治疗的基础。开发用于实体瘤靶向用药指导的多基因检测方法就显得尤为重要，根据检测到的基因分型，制定最佳治疗方案，以最大化药物的利用价值，突破传统治疗的局限性，避免患者通过以身试药的方式选择有效方案，也避免了不适用药物带来的严重毒副作用，提升患者的生存期和生活质量。
技术实现思路
本专利技术提供了用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法。该方法利用多探针靶向捕获技术结合二代测序技术，用于富集和检测实体瘤中多个基因的变异情况，即以下76个基因的变异情况(如突变，缺失，插入，融合，拷贝数变化)：ABL1、ABL2、AKT1、AKT3、ALK、APC、ARAF、ARID1A、ATM、BCL2L11(BIM)、BCR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CCND1、CD274(PD-L1)、CDH1、CDK4、CDK6、CDKN2A、CDKN2B、CTNNB1、DDR2、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ESR1、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、IDH1、IDH2、JAK1、JAK2、KDR、KIT、KRAS、LRP1B、MAP2K1、MET、MLH1、MSH2、MSH6、MTOR、NF1、NF2、NOTCH1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PDCD1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、PMS2、PTCH1、PTEN、RAF1、RARA、RB1、RET、ROS1、SMAD4、SMO、SRC、STK11、TP53、TSC1、TSC2、VEGFA、VHL。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一方面，本专利技术提供了一种富集目标基因靶片段的方法，所述方法包括以下步骤：1)DNA抽提：样本DNA抽提；2)文库构建：将DNA样本进行片段化；片段化DNA末端修复和加碱基A，并与带有T碱基接头(Adaptor/Adapter)连接，使用接头相应的扩增引物对纯化后的连接产物进行PCR扩增；3)文库捕获：将步骤2)获取的文库与DNA捕获探针进行杂交，去除未结合的DNA，获得的DNA即为富集的目标基因靶片段。其中，所述步骤1)样本，优先为人，且来自其组织、细胞或者体液；所述步骤1)DNA，包括提取的全基因组DNA或者游离DNA；当提取的DNA为游离DNA时，步骤2)不需要进行片段化操作。所述步骤2)进行片段化，优先地，使用超声破碎仪进行片段化。优先地，片段主峰大小(Peaksize)为250bp。所述步骤3)DNA捕获探针，是指能够与目标基因进行杂交的带有选择性标记的多个探针的混合物。优先地，选择性标记为生物素。所述探针通过以下方式获得：3-1)将目标基因的DNA序列及其两侧的侧翼序列作为目标区域，设计多个能够与目标区域杂交的DNA探针；3-2)DNA探针的长度限定为120个碱基，探针以叠瓦式设计，完整覆盖全部待测基因片段和两端50bp范围的序列，探针间重叠部分为12个碱基。所述步骤3)去除未结合的DNA，是指通过DNA捕获探针上的选择性标记分离杂交产物。优先地，当选择性标记为生物素时，利用链霉亲和素与生物素的亲和作用分离杂交产物。另一方面，本专利技术还提供一种检测目标基因变异的方法，所述方法包括以下步骤：1)根据上述方法富集目标基因靶片段，使用接头相应的扩增引物对其进行PCR扩增；2)经纯化后，通过二代测序技术对扩增产物进行基因变异的检测。优先地，所述基因变异包括以下一种或几种：点突变，小片段插入/缺失，拷贝数变化，融合/基因组重排，包含大片段插入/缺失(大于100bp)。本专利技术的主要优点在于：对实体瘤中经常变异的76个基因同时进行捕获探针设计试验优化，获得了用于富集这些基因的探针混合物。利用这些探针混合物仅通过一次富集患者样本DNA，结合二代测序技术，就能准确快速达到检测用于实体瘤用药指导的基因变异的目的。附图说明图1是本专利技术技术方案的流程图；图2A是本专利技术实施例2构建文库LabChip检测图(AllPeaks)；图2B是本专利技术实施例2构建文库LabChip检测图(SamplePeaks)；图3A是本专利技术实施例3捕获文库LabChip检测图(AllPeaks)；图3B是本专利技术实施例3捕获文库LabChip检测图(SamplePeaks)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件中所述的方法进行。按照图1的技术方案流程图具体如下：实施例1DNA样本库准备1.全基因组DNA(gDNA)抽提以FFPE样本gDNA抽提为例，步骤如下：采用QIAampDNAFFPETissueKit(Qiagen，货号：56404)提取FFPE样本gDNA。按照说明书要求进行操作。使用NanoDrop(ThermoFisher，货号：ND-2000)和dsDNAHSAssayKit(ThermoFisher，货号：Q32854)检测DNA的质量和浓度。按照说明书要求进行操作。2.DNA片段化取适量gDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富集实体瘤76个目标基因靶片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)DNA抽提：样本DNA抽提；其中，所述步骤1)中的样本为来自人的组织、细胞或者体液。2)文库构建：将DNA样本进行片段化；片段化DNA末端修复和加碱基A，并与带有T碱基接头(Adaptor/Adapter)连接，使用接头相应的扩增引物对纯化后的连接产物进行PCR扩增；其中，所述步骤2)中的进行片段化是使用超声破碎仪进行片段化。3)文库捕获：将步骤2)获取的文库与DNA捕获探针进行杂交，去除未结合的DNA，获得的DNA即为富集的目标基因靶片段。其中，所述步骤3)中的DNA捕获探针，是指能够与目标基因进行杂交的带有选择性标记的多个探针的混合物。所述探针通过以下方式获得：3‑1)将目标基因的DNA序列及其两侧的侧翼序列作为目标区域，设计多个能够与目标区域杂交的DNA探针；3‑2)DNA探针的长度限定为120个碱基，探针以叠瓦式设计，完整覆盖全部待测基因片段和两端50bp范围的序列，探针间重叠部分为12个碱基。

【技术特征摘要】
1.一种富集实体瘤76个目标基因靶片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)DNA抽提：样本DNA抽提；其中，所述步骤1)中的样本为来自人的组织、细胞或者体液。2)文库构建：将DNA样本进行片段化；片段化DNA末端修复和加碱基A，并与带有T碱基接头(Adaptor/Adapter)连接，使用接头相应的扩增引物对纯化后的连接产物进行PCR扩增；其中，所述步骤2)中的进行片段化是使用超声破碎仪进行片段化。3)文库捕获：将步骤2)获取的文库与DNA捕获探针进行杂交，去除未结合的DNA，获得的DNA即为富集的目标基因靶片段。其中，所述步骤3)中的DNA捕获探针，是指能够与目标基因进行杂交的带有选择性标记的多个探针的混合物。所述探针通过以下方式获得：3-1)将目标基因的DNA序列及其两侧的侧翼序列作为目标区域，设计多个能够与目标区域杂交的DNA探针；3-2)DNA探针的长度限定为120个碱基，探针以叠瓦式设计，完整覆盖全部待测基因片段和两端50bp范围的序列，探针间重叠部分为12个碱基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的DNA，包括提取的全基因组DNA或者游离DNA。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的DNA为提取的游离DNA，所述步骤2)不需要进行片段化操作。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的进行片段化，片段主峰大小(Peaksize)为250bp。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的选择性标记为生物素。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的选择性标记为生物素，所述步骤3)中的去除未结合的DNA是利用链...

【专利技术属性】
技术研发人员：亢卉，程磊，胡忠祥，秦公炜，王凯，
申请(专利权)人：至本医疗科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31