与骨折愈合相关的miRNA标志物及其检测引物和应用制造技术

本发明专利技术公开一种与骨折愈合相关的miRNA标志物及其检测引物和应用。该miRNA标志物的序列为SEQ ID NO:1：GGCAUCGGCUGAACCUGCGU。该检测引物包括逆转录引物和实时荧光定量PCR引物；其中，逆转录引物的序列为SEQ ID NO:2：TACCGTAGCCGACTTGGACGCACC；实时荧光定量PCR引物的序列为ACTTGACGCTAATACCAT和SEQ ID NO:4：CTACCGTTGAATTACTTA。本发明专利技术提供的miRNA标志物是一种新的miRNA标志物，用该标志物可以预测骨折愈合是否良好的情况，当其在骨折愈合患者骨痂中表达相对增高时，即可以表明骨折愈合不良。

【技术实现步骤摘要】
与骨折愈合相关的miRNA标志物及其检测引物和应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种与骨折愈合相关的miRNA标志物及其检测引物和应用。
技术介绍
骨折愈合的标准有局部无压痛、无纵向叩击痛；局部无异常活动；X线照片显示骨折线模糊、有连续性骨痂通过骨折线等等。骨折愈合的基础是骨膜成骨细胞再生。一般将骨折愈合分为三个阶段，即血肿机化期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑形期；也有根据骨折愈合过程的组织学和生理学特征分为撞击期、诱导期、炎症期、软骨痂期、硬骨痂期和改建期6个不同的阶段。多种骨生长因子与骨折愈合有关，它们共同作用可刺激成骨细胞的活性，调节局部成骨。现有骨折愈合是否良好的检测方法有限。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用，每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因，这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。HiSeq深度测序所得的小分子(SmallRNA，sRNA)几乎涵盖所有的RNA，包括miRNA、siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、exon或intron降解片段等，其中miRNA、siRNA以及piRNA是研究的热点。对于测序所得的序列的鉴定，生物信息分析上一般通过与各类已知的数据库进行比对、寻找样品与数据库之间在基因组位置上的覆盖等方法，对sRNA进行注释分类。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种与骨折愈合相关的miRNA标志物及其检测引物和应用，旨在解决现有骨折愈合是否良好的诊断方法有限的技术问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一方面，本专利技术提供一种与骨折愈合相关的miRNA标志物，所述miRNA标志物的序列为SEQIDNO:1：GGCAUCGGCUGAACCUGCGU。另一方面，本专利技术提供一组上述miRNA标志物的检测引物，所述检测引物包括逆转录引物和实时荧光定量PCR引物；其中，所述逆转录引物的序列为SEQIDNO:2：TACCGTAGCCGACTTGGACGCACC；所述实时荧光定量PCR引物的序列为SEQIDNO:3：ACTTGACGCTAATACCAT和SEQIDNO:4：CTACCGTTGAATTACTTA。最后，本专利技术还提供一种上述检测引物在制备骨折愈合辅助诊断试剂盒方面的应用。本专利技术提供的miRNA标志物是一种新的miRNA标志物，通过试验证明，用该标志物可以预测骨折愈合是否良好的情况，当该miRNA标志物在骨折愈合患者骨痂中表达相对增高时，即可以表明骨折愈合不良，因此，可以作为预测骨折愈合好坏的分子标志物。本专利技术提供的检测引物可实现对上述miRNA标志物的表达量检测，从而进一步预测骨折愈合是否良好，因此，该检测引物灵活实用，方便检测，可用于制备骨折愈合辅助诊断试剂盒。附图说明图1为本专利技术实施例3的荧光定量PCR结果示意图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种与骨折愈合相关的miRNA标志物，该miRNA标志物的序列为SEQIDNO:1：GGCAUCGGCUGAACCUGCGU。本专利技术实施例提供的miRNA标志物是一种新的miRNA标志物，将其定义为novel-miR-116；用该标志物可以预测骨折愈合是否良好的情况，当novel-miR-116在骨折愈合患者骨痂中表达相对增高时，即可以表明骨折愈合不良，因可以作为预测骨折愈合好坏的分子标志物。另一方面，本专利技术实施例还提供一组检测上述miRNA标志物的检测引物，该检测引物包括逆转录引物和实时荧光定量PCR引物；其中，逆转录引物的序列为SEQIDNO:2：TACCGTAGCCGACTTGGACGCACC；实时荧光定量PCR引物的序列为SEQIDNO:3：ACTTGACGCTAATACCAT和SEQIDNO:4：CTACCGTTGAATTACTTA。用该组检测引物可实现对miRNA标志物(即novel-miR-116)的表达量检测，从而进一步预测骨折愈合是否良好；因此，该检测引物灵活实用，方便检测，可用于制备骨折愈合辅助诊断试剂盒。最后，本专利技术还提供一种利用上述检测引物在制备骨折愈合辅助诊断试剂盒方面的应用。实施例1候选miRNA预测方法候选miRNA的预测主要是通过针对miRNA的生物特征的筛选得到的，miRNA初始转录位点多位于基因间隔区、内含子以及编码序列的反向重复序列上，其前体具有标志性的发夹结构，成熟体的形成是由Dicer酶的剪切实现的，通过考虑整个miRNA的发育过程，本实施例使用一套miRNA预测软件Mireap。本实施例的一些关键条件描述如下：(1)miRNA预测的基础数据包括通过小RNA分类注释后未注释到任何数据库的但可以比对到基因组的序列、比对到内含子区域的序列以及比对到外显子反义链的数据；(2)候选的miRNA在基因组上的前体序列可以形成颈环结构，并且其成熟体序列位于前体的臂上；(3)前体折叠后miRNA/miRNA*复合体两端有2nt的悬挂；(4)前体臂上无较大的泡，同时没有较多的凸起；(5)前体折叠后总体的最小自由能应不大于-18kcal/mol；(6)预测到前体的成熟体序列的比对结果中最小支持数应大于等于5。预测到的新的miRNA表达谱构建：根据比对结果计算预测到的miRNA其表达量，序列与成熟体序列在两端不超过3nt的错配，中间需完全匹配，符合这样条件的序列的表达量加和作为该miRNA的表达量。本实施例采用华大基因自主研发的软件-Mireap进行预测，该软件设置动物参数如下：MinimalmiRNAsequencelength(18)即miRNA最小长度为18；MaximalmiRNAsequencelength(26)即miRNA最大长度为26；MinimalmiRNAreferencesequencelength(20)即miRNA最小参考序列长度为20；MaximalmiRNAreferencesequencelength(24)即miRNA最小参考序列长度为24；MinimaldepthofDrosha/Dicercuttingsite(3)即Drosha/Dicer切割位点最小深度为3；MaximalcopynumberofmiRNAsonreference(20)即参考序列上miRNA最大拷贝数为20；MaximalfreeenergyallowedforamiRNAprecursor(-18kcal/mol)即miRNA最大自由能为-18kcal/mol；MaximalspacebetweenmiRNAandmiRNA*(35)即miRNA和miRNA*最大空间为35；MinimalbasepairsofmiRNAandmiRNA*(14)即miRNA和miRNA*最小碱基对为14；MaximalbulgeofmiRNAandmiRNA*(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与骨折愈合相关的miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物的序列为SEQ ID NO:1：GGCAUCGGCUGAACCUGCGU。

【技术特征摘要】
1.一种与骨折愈合相关的miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物的序列为SEQIDNO:1：GGCAUCGGCUGAACCUGCGU。2.一组如权利要求1所述的miRNA标志物的检测引物，其特征在于，所述检测引物包括逆转录引物和实时荧光定量PCR引物；其中，所述逆转录引物的序列为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘黎军，陈磊，陈洁琳，张胜利，韩云，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东,44