均环肽Cyclo‑[(Asn)5‑Cys]的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种均环肽Cyclo‑[(Asn)5‑Cys]的制备方法，包括：(1)树脂与带保护基的天冬酰胺连接，形成连接有一个天冬酰胺的树脂；(2)树脂连接的一个天冬酰胺与带保护基的天冬酰胺和半胱氨基酸依序缩合，形成连接有直链肽的树脂；(3)直链肽从树脂上切割下来，首尾相连环化，得到环肽粗品；(4)环肽的纯化与保存。本发明专利技术的Cyclo‑[(Asn)5‑Cys]为均环肽结构，具有与冠醚类化合物相似的结构，与杂环肽相比，其分子在结构上具有更好的规整性，更易于自组装成为离子通道或者纳米管，从而作为药物载体、膜通道、分子器件等；侧链上含有五个氨基官能团，使得其具有一定的水溶性和生物活性；侧链上还含有一个巯基官能团，使得其具有更好的反应活性，可作为高效点击反应的前体试剂。

All cyclic peptide Cyclo [(Asn) 5 preparation methods of Cys]

The invention discloses a homocyclic peptide [Cyclo (Asn) method includes the preparation of 5 Cys]: (1) is connected with the base with protective resin asparagine, forming a resin with asparagine; (2) a resin asparagine linked with protection and asparagine radical and cysteamine the amino acid sequence of condensation, formation of resin is connected with a straight chain peptide; (3) straight chain peptide cut from the resin, end to end ring, ring to get crude peptides; (4) the purification and preservation of cyclic peptide. The invention of the Cyclo [(Asn) Cys] 5 homocyclic peptide structure with crown ether compounds with similar structure, compared with the heterocyclic peptide, its molecule has better regularity in structure, easy to self assemble into ion channels or nanotubes, which used as drug carrier, membrane channels and molecular devices; the side chain containing five amino groups, which can be dissolved in water and biological activity; the side chain also contains a thiol functional group, which has better reaction activity, can be used as the precursor reagents high click reaction.

【技术实现步骤摘要】
均环肽Cyclo-[(Asn)5-Cys]的制备方法
本专利技术属于多肽合成
，涉及环肽类化合物的化学制备方法，尤其涉及均环肽化合物Cyclo-[(Asn)5-Cys]及其合成制备方法。
技术介绍
环肽在结构组成上与普通链状肽类具有结构的高度相似性，但因其主体结构中氨基酸残基参与连接成环，以致分子中的游离羧基、氨基等亲水基团消失或减少，使得其极性降低、脂溶性增强、对体内氨/羧肽酶的敏感性降低、在生物体内的稳定性增加；同时，肽链运动的自由度减少，在溶液中具有相对稳定的明确构象，与受体契合的可能性明显提高。现有技术中，合成环肽首先是合成链状肽前体。链状肽的合成方法目前主要有固相法和液相法两种合成方式，由于固相法独特的优势，已成为实验室多肽合成的首选方法，直链肽的合成已趋自动化和商业化，但环肽的合成还存在着一定的难度，其关键问题在于链状肽的合环步骤。通常环状肽的合环方式分为首尾相连、侧链之间相连、侧链与端基相连，或借助于二硫键、酯键(宓鹏程,潘俊峰,马亚平,袁建成.一种环酯肽OrafamideA的固相合成方法.CN103626848B[P].2013-11-29)等相连；其中，链状肽首尾相连成环的合成难度更大，但也更具有研究意义。通常情况下，合成首尾相连型环肽的经典方法是在稀溶液(10-3～10-4mol.L-1)中，用活泼酯法或叠氮法将带有保护基的的线性前体肽选择性地活化并合环；使用二环己基碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)等有机缩合剂，产率通常低于30％，且反应时间很长。近年来，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)等苯并唑类有机缩合剂的使用，为环肽合成方法的研究提供了很大帮助；但迄今为止，主要应用于RGD环肽(含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的环肽)的合成(王锡平.RGD合成制备工艺.CN,103588863B[P].2013-11-15.)，尚未见有关新型环肽Cyclo-[(Asn)5-Cys]，尤其是其化学制备方法相关工艺的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种均环肽Cyclo-[(Asn)5-Cys]的制备方法，包括：步骤一、将树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和酰胺基带三苯甲基保护基的天冬酰胺、N,N-二异丙基乙胺加入树脂中，再加入DMF使之溶解，室温下震荡反应30～60min；然后加入甲醇孵育20min；用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上；去掉溶剂后，加入裂解液，去除天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰基；取样检测确保氨基酸已经连接在树脂上，且已裸露出不带保护的氨基；步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和酰胺基带三苯甲基保护基的天冬酰胺，同时加入缩合试剂，与树脂上氨基酸进行缩合，然后去掉溶剂后，加入裂解液，去除天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复三次上述操作，直至天冬酰胺偶联完全，脱除最后一个天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰，得到树脂-天冬酰胺缩合物，加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸，同时加入缩合试剂，与最后一个天冬酰胺缩合；加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基；步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来；用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段；用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂，完成环化反应；采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入裂解液，脱除酰胺基和巯基上的保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20℃保存。优选的是，所述树脂为2-氯三苯甲基氯树脂、4-甲苯氢胺树脂、Wang树脂中的任意一种，所述溶胀的条件为加二氯甲烷浸泡，并震荡30min；其中天冬酰胺与树脂连接的位置为其未保护的羧基。优选的是，所述步骤一和步骤二中，取样检测的方法为：取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5％的茚三酮乙醇溶液、0.3％的抗坏血酸溶液、60％的苯酚溶液各一滴，同时加热至100～110℃并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基。优选的是，所述步骤一和步骤二中，每次所加入的氨基带芴甲氧羰酰基保护基和酰胺基带三苯甲基保护基的天冬酰胺的用量均三倍摩尔过量于树脂；所述步骤一和步骤二中，去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20％哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂。优选的是，所述步骤二中，天冬酰胺之间的缩合，采用的试剂及反应条件为：加入缩合试剂三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入N,N-二异丙基乙胺十倍摩尔过量，反应30min，反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂；所述步骤二中，天冬酰胺与半胱氨酸之间的缩合，采用的试剂及反应条件为：加入缩合试剂三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量或N,N-二异丙基碳二亚胺三倍摩尔过量，反应30min，反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂；所述缩合试剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸中的任意一种。优选的是，所述步骤三中，将直链肽从树脂上切割下来时所选用切割液为：三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为30～40％，切割条件为加入切割液后常温孵育反应2h；所述步骤三中，直链肽环化的反应条件为：加入环化试剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基三倍摩尔过量、1-羟基苯并三氮唑三倍摩尔过量、N,N-二异丙基乙胺十倍摩尔过量，45～50℃回流反应24h。优选的是，所述步骤三中，裂解液为为体积比为95:2:2:1的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和纯水组成的混合液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2～3h。优选的是，所述步骤四中环肽的纯化阶段，HPLC采用的色谱柱为反相C18制备柱，淋洗液为0.1％三氟乙酸的水溶液A和0.1％三氟乙酸的乙腈溶液B，淋洗条件设置：5min，A90％，B10％；15min，A60％，B40％，15.10min停止。优选的是，所述步骤一中，在震荡反应之前将带保护基的天冬酰胺、N,N-二异丙基乙胺、树脂和DMF加入球形容器中，并将球形容器置于四轴研磨仪上，开启四轴研磨仪，带动球形容器无规旋转，反应10～15min；所述球形容器的进料口通过螺纹盖密封，螺纹盖密封连接后与球形容器的表面齐平；所述四轴研磨仪的主动轴转速为100～120rpm，随机转变频率为15～20s。优选的是，所述步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种均环肽Cyclo‑[(Asn)5‑Cys]的制备方法，其特征在于，包括：步骤一、将树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和酰胺基带三苯甲基保护基的天冬酰胺、N,N‑二异丙基乙胺DIEA加入树脂中，再加入二甲基甲酰胺DMF使之溶解，室温下震荡反应30～60min；然后加入甲醇孵育20min；用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上；去掉溶剂后，加入裂解液，去除天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰基；取样检测确保氨基酸已经连接在树脂上，且已裸露出不带保护的氨基；步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和酰胺基带三苯甲基保护基的天冬酰胺，同时加入缩合试剂，与树脂上氨基酸进行缩合，然后去掉溶剂后，加入裂解液，去除天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复三次上述操作，直至天冬酰胺偶联完全，脱除最后一个天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰，得到树脂‑天冬酰胺缩合物，加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸，同时加入缩合试剂，与最后一个天冬酰胺缩合；加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基；步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来；用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段；用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂，完成环化反应；采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入裂解液，脱除酰胺基和巯基上的保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，‑20℃保存。...

【技术特征摘要】
1.一种均环肽Cyclo-[(Asn)5-Cys]的制备方法，其特征在于，包括：步骤一、将树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和酰胺基带三苯甲基保护基的天冬酰胺、N,N-二异丙基乙胺DIEA加入树脂中，再加入二甲基甲酰胺DMF使之溶解，室温下震荡反应30～60min；然后加入甲醇孵育20min；用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上；去掉溶剂后，加入裂解液，去除天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰基；取样检测确保氨基酸已经连接在树脂上，且已裸露出不带保护的氨基；步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和酰胺基带三苯甲基保护基的天冬酰胺，同时加入缩合试剂，与树脂上氨基酸进行缩合，然后去掉溶剂后，加入裂解液，去除天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复三次上述操作，直至天冬酰胺偶联完全，脱除最后一个天冬酰胺氨基上的保护基芴甲氧羰酰，得到树脂-天冬酰胺缩合物，加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸，同时加入缩合试剂，与最后一个天冬酰胺缩合；加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基；步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来；用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段；用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂，完成环化反应；采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入裂解液，脱除酰胺基和巯基上的保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20℃保存。2.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-[(Asn)5-Cys]的制备方法，其特征在于，所述树脂为2-氯三苯甲基氯树脂、4-甲苯氢胺树脂、Wang树脂中的任意一种，所述溶胀的条件为加二氯甲烷DCM浸泡，并震荡30min；其中天冬酰胺与树脂连接的位置为其未保护的羧基。3.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-[(Asn)5-Cys]的制备方法，其特征在于，所述步骤一和步骤二中，取样检测的方法为：取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5％的茚三酮乙醇溶液、0.3％的抗坏血酸溶液、60％的苯酚溶液各一滴，同时加热至100～110℃并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基。4.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-[(Asn)5-Cys]的制备方法，其特征在于，所述步骤一和步骤二中，每次所加入的氨基带芴甲氧羰酰基保护基和酰胺基带三苯甲基保护基的天冬酰胺的用量均三倍摩尔过量于树脂；所述步骤一和步骤二中，去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20％哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂。5.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-[(...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋宏涛，
申请(专利权)人：中国工程物理研究院核物理与化学研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51