本发明专利技术涉及免疫细胞靶向治疗技术领域，特别涉及一种人体外周血单个核细胞诱导分化为记忆性免疫细胞，冷冻的外周血单个核细胞诱导的TCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础，可根据肿瘤患者的治疗方案随时复苏细胞，解决了肿瘤患者T细胞增殖能力差和免疫无能问题；目前回输的免疫细胞尤其是克隆化效应T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞具有长效记忆性，通过TCR基因转染TCM，赋予TCM细胞靶向性。
Memory immune cells induced by peripheral blood mononuclear cells and its application
The present invention relates to the technical field of immune cells targeting therapy, in particular to a human peripheral blood mononuclear cells differentiate into memory cells of the immune system, TCM cells using frozen peripheral blood mononuclear cells induced to provide the basis for clinical treatment of tumor, cell recovery at any time according to the treatment of cancer patients, solve the proliferation of tumor cells in patients with T ability and immune incompetent problems; currently transfusion immune cells especially the cloning of effector T cells in the body to survive for a long time, has a great impact on clinical efficacy of adoptive cell therapy. Memory T cells have long term memory ability and are targeted to TCM cells by transfection of TCM through TCR gene.
【技术实现步骤摘要】
外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞及应用
本专利技术涉及免疫细胞靶向治疗
，特别涉及一种人体外周血单个核细胞诱导分化为记忆性免疫细胞（TCM），还涉及记忆性免疫细胞（TCM）的应用。
技术介绍
过继性细胞治疗技术为打破肿瘤患者中枢和外周免疫耐受，恢复或增强其抗肿瘤免疫功能提供了一种有效的方法。然而目前还存在不少问题亟待解决，包括：1)如何获得充分数量的肿瘤反应性T细胞是决定过继性细胞治疗效果的最关键因素；2)目前回输的免疫细胞尤其是克隆化CD8+T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞在体内再次遭遇相同抗原时可迅速活化发挥免疫效应，同时具有自我更新能力,能够提供更为长期的免疫保护，可能为过继性细胞治疗提供更为合适的免疫效应细胞。有望在回输体内后建立更长期的抗肿瘤免疫。分离记忆性T细胞并通过TCR基因转染有望提供具有更强生存能力和效应功能的肿瘤反应性T细胞。
技术实现思路
为了解决过继性细胞治疗技术中免疫细胞在体内难以长期存活，缺少靶向性的问题；本申请提供了一种从低温冻存的外周血单个核细胞（PBMC）中分离纯化记忆性T细胞（TCM），TCM诱导活化率高的诱导方法，然后将肿瘤特异TCR基因转染自体TCM，使免疫细胞治疗具有长效性和靶向性。本专利技术是通过以下步骤得到的：本专利技术利用低温冻存技术保存人体外周血单个核细胞，预先储存健康的免疫细胞，当日后患者需要治疗时，复苏并分离纯化TCM，并诱导为杀伤性T细胞，肿瘤特异TCR基因转染自体TCM，使免疫细胞治疗具有靶向性。解决肿瘤患者记忆性T细胞增殖能力差和免疫无能的问题。一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后记忆性T细胞分离纯化、诱导活化和肿瘤特异TCR基因转染自体TCM的方法，包括以下步骤：健康人PBMC冻存复苏，从中分离纯化TCM，研究体外活化后，CIK细胞和TCM来源的效应T细胞（TE）细胞分化表型的差异。并以肿瘤抗原特异性TCR基因修饰CIK和TCM，明确TCR基因修饰CIK和TCM的抗肿瘤免疫功能。1.CIK诱导：PBMC按照细胞密度(0.4-1.2)×106/mL用X-VIVO15重悬，添加300-2000u/mLIFN-γ和50-100u/mLATP诱导培养CIK细胞，第二天补加因子50-200u/mLIL-1α、500-2000u/mLIL-2、500-1000u/mLIL-7、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28；此后每天观察细胞生长状态，每隔1-2天添加含有500-2000u/mLIL-2的X-VIVO15培养基。2.TCM的分选、刺激与基因转染(1)磁珠负性筛选CD8+T细胞，二次阳性分选TCM。(2)协同刺激抗体/细胞因子初次刺激（培养后第1天）。以300-2000u/mLIFN-γ、抗人50-200ng/mLCD3单克隆抗体、50-200ng/mLCD28单克隆抗体及500-2000u/mL重组人IL-2和50-200u/mLIL-1α完成初次刺激。每2天半量换液，补加500-2000u/mL重组人IL-2、500-1000u/mLIL-7和500-1000u/mL重组人IL-15。（3）重组TCR腺病毒转染（培养后第3天）CIK细胞及TCM细胞。（4）培养后5天进行肿瘤抗原再刺激。（5）台盼蓝染色法获取CIK细胞及TCM体外刺激活化后生长曲线（至体外培养至35天）。（6）流式细胞术荧光原位杂交法检测活化后细胞数量高峰期（第14天）CIK细胞与TCM来源TE端粒相对长度。3.CIK与TCM来源TE细胞分化表型：流式细胞术检测CIK细胞与TCM经刺激活化后CD45RO、CD62L、CD44、CCR7、CD28等标CIK与TCM来源TE细胞分化表型记分子表达与动态变化（至体外培养后第33天）。6.TCR基因转染CIK和TCM来源TE的抗肿瘤免疫功能：（1）流式细胞术检测腺病毒转染后外源TCR基因表达效率（转染后第3-14天）；（2）CTL活性：肿瘤抗原再刺激后一天，以钙黄绿素标记靶细胞（HepG-2，SMMC-7721,MCF-7）检测分别来源于CIK细胞，TCM，TCR基因转染CIK细胞，TCR基因转染TCM的各组TE不同效靶比对靶细胞的特异性裂解百分比。（3）抗体阻断实验：抗人HLA-A2抗体与HLA-A2阳性靶细胞HePG-2和SMMC-7721共孵育后，钙黄绿素释放法检测抗体阻断对TCR基因转染TCM来源TE的CTL活性影响。（4）细胞裂解核蛋白分泌：肿瘤抗原再刺激后一天，各组TE细胞作用于靶细胞HEPG2，SMMC7721后4小时。胞内细胞因子染色法检测T细胞内新合成的穿孔素与颗粒酶分泌。（5）细胞因子分泌：肿瘤抗原再刺激后一天，各组TE细胞作用于靶细胞HEPG2，SMMC77-721，MCF24小时后，ELISA法检测细胞培养液上清中IFN-r，IL-2含量。7.统计学分析实验数据以均数士标准差来表示。应用SPSS16.0统计软件进行统计分析。各指标先进行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2x2析因设计的方差分析（不同组细胞肿瘤杀伤活性比较，抗体抑制试验，各组细胞的细胞因子分泌。采用重复测量的方差分析完成各组细胞不同时间地点细胞数量分析。采用单因素方差分析对不同组细胞端粒长度进行分析。当P<0.05时，被认为差异具有统计学意义。优选步骤（2）TCM分选、刺激和TCR基因转染：分离后第1天，以1000IU/mlIFN-γ、抗人130ng/mlCD3单克隆抗体、抗人110ng/mlCD28单克隆抗体及重组人1000IU/mlIL-2、120u/mLIL-1α完成初次刺激。每2天半量换液，补加重组人IL-2(终浓度为1000IU/ml)、800u/mLIL-7和800u/mL重组人IL-15。利用冻存技术保存了PBMC的活性，本实验证实使用冷冻过的外周血单个核细胞能够定向分离纯化TCM，体外诱导活化后，TCM来源的效应T细胞（TE）其扩增能力、细胞纯度和细胞毒活性均与新鲜细胞直接诱导生成的TCM细胞没有明显的差别。体外培养过程中，与CIK细胞相比，来自TCM细胞的TE细胞具有更高的增殖倍数；TCR基因转染TCM细胞来源TE的CTL活性具有抗原特异性和MHC限制性。本实验结果为冷冻的外周血单个核细胞诱导的TCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础，可根据肿瘤患者的治疗方案随时复苏细胞，使现有的抗肿瘤免疫治疗方法更加灵活多变，解决了肿瘤患者T细胞增殖能力差和免疫无能问题。本专利技术所述疾病包括但不限于肾癌、恶性黑色素瘤、肺癌、肝癌、大肠癌、胃癌、淋巴瘤等。本专利技术的有益效果：1）本专利技术为冷冻的外周血单个核细胞诱导的TCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础，可根据肿瘤患者的治疗方案随时复苏细胞，解决了肿瘤患者T细胞增殖能力差和免疫无能问题；2)目前回输的免疫细胞尤其是克隆化效应T细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞具有长效记忆性，通过TCR基因转染TCM，赋予TCM细胞靶向性。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：实施例1一、PBMC细胞的分离与冻存：a.PBMC细胞的分离：外周血用电动助吸器按照每管不多于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞，其特征在于将新鲜分离的或者经过冻存后复苏的外周血单个核细胞经过筛选和二次阳性分选出记忆性免疫细胞，诱导后即得。
【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞，其特征在于将新鲜分离的或者经过冻存后复苏的外周血单个核细胞经过筛选和二次阳性分选出记忆性免疫细胞，诱导后即得。2.根据权利要求1所述的记忆性免疫细胞，其特征在于诱导分化操作如下：（1）记忆性免疫细胞分离后重悬，加入300-2000u/mLIFN-γ、抗人50-200ng/mLCD3单克隆抗体、50-200ng/mLCD28单克隆抗体及500-2000u/mL重组人IL-2和50-200u/mLIL-1α完成初次刺激；（2）每2天半量换液，补加500-2000u/mL重组人IL-2、500-1000u/mLIL-7和500-1000u/mL重组人IL-15，培养时间为12-20天。3.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于诱导后使用重组TCR腺病毒转染。4.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于步骤（1）中将记忆性免疫细胞用X-VIVO15重悬。5.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于步骤（1）中重悬的浓度为(0.4-1.2)×106/mL。6.根据权利要求2所述的记忆性免疫细胞，其特征在于步骤（1）中...
【专利技术属性】
技术研发人员：路春光，
申请(专利权)人：路春光，
类型：发明
国别省市：吉林,22
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