本发明专利技术涉及免疫细胞靶向治疗技术领域，传统CAR-T细胞扩增程序中，通过CD3/CD28单抗激活的单核细胞经白介素2进一步扩增后，大多数T细胞为高度分化的效应/记忆T细胞，自我更新能力较弱，移植后体内存活时间短，致使治疗效果较差，本研究通过TSCM代替T细胞，扩增后TSCM比例高达44.41%，极大的改善移植后体内免疫细胞的存活时间，提高治疗效果。PiggyBac和Sleep Bueaty载体容量都远远超过病毒，甚至可以达到100kb以上，几乎可以容下所有我们试图添加的元件，不存在包装环节和序列特异性要求，无论是从CAR-TSCM未来研发的需求还是从降低成本开拓市场的可能来看，都是最佳的候选者。都是最佳的候选者。
【技术实现步骤摘要】
新型非病毒载体TSCM基因疗法的构建方法及临床应用
[0001]本专利技术涉及免疫细胞靶向治疗
，特别涉及一种优化的从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞或脐血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞诱导扩增干细胞样记忆性T细胞（TSCM），通过转座子载体系统搭建这一新型CAR-TSCM平台，在未来细胞免疫治疗领域的竞争中抢得先机。
技术介绍
[0002]当前CAR采用的主要载体系统是应用慢病毒(Lentivirus)，其具有的高效包装和高效感染特性，使其成为适合对T细胞进行遗传改造的病毒载体。
[0003]随着需要治疗的癌症种类增加和对治疗效果要求的提升，对于CART载体系统也提出了更多的挑战，多靶标系统（提高靶向性），多细胞因子共表达（去除免疫抑制），诱导表达系统(调控靶向分子表达)，自杀系统（防止过激免疫和控制CART寿命），TCR/MHCI敲除系统(阻止GVDH和免疫排斥)等等相关元件和系统的添加，有效的改进了CART的疗效，但对于载体的容量和可包装性提出了很高的要求。慢病毒载体的容量只能容纳CART的基本元件，对于更多的元件是无能为力的；同时也存在费用高、包装困难、免疫原性强、潜在致癌性强、CART疗效持续性不好等等显著缺陷。传统CAR-T细胞扩增程序中，通过CD3/CD28单抗激活的单核细胞经白介素2进一步扩增后，大多数T细胞为高度分化的效应/记忆T细胞，自我更新能力较弱，移植后体内存活时间短，致使治疗效果较差，本研究通过TSCM代替T细胞，扩增后TSCM比例高达44.41%，极大的改善移植后体内免疫细胞的存活时间，提高治疗效果。我们急需开发出一个崭新的CAR-TSCM载体平台，容纳下所有有助于治疗的新型元件，便于下一阶段的新产品开发，这个平台必须具有大容量、无序列特异性要求、弱免疫原性、高效而可控的外源基因表达能力、低成本、操作简便、持续发挥CAR-TSCM功效而避免其潜在致癌可能，以避免目前基于慢病毒的CAR-TSCM系统的显著缺点，极大的改进细胞治疗效果和扩大治疗范围。纵观现有的生物技术，只有转座子系统堪当此任。以在人和哺乳动物中应用得最有效的PiggyBac和Sleep Bueaty系统而言，它们的载体容量都远远超过病毒，甚至可以达到100kb以上，几乎可以容下所有我们试图添加的元件，而且不存在包装环节和序列特异性要求，无论是从CAR-TSCM未来研发的需求还是从降低成本开拓市场的可能来看，都是最佳的候选者。
[0004]本专利技术人2019年专利技术了《临床用TSCM诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用》（专利号：2019103666958），建立了TSCM高效诱导试剂盒体系，本专利技术在于搭建成功基于转座子系统的CAR-TSCM平台。专利2019101633911中也公布了一种CAR-TSCM制备方法，其利用的是慢病毒载体构建CAR-TSCM，而且是通过磁珠分选T细胞，成本高，效率低。本专利技术的创新之处在于，在国内第一次建立基于转座子原理的非病毒CAR-TSCM系统，这个平台对所有的相关技术系统都是开放的，并实现高度的兼容性，确保随着技术进步，我们的CAR-TSCM产品也能同步改进，突破所有的技术屏障，持续保持领先地位。反观其他载体系统，由于容量和系统特性，往往不能兼容新技术而变成竞争状态，很容易遭到淘汰，技术陈旧速度太快，给公司
研发带来巨大风险，选择了正确的平台，就选择了未来无穷的改进空间，在残酷竞争中能够利于不败之地，同时这个平台对于其他严重的遗传疾病、传染疾病、慢性功能丧失性疾病等都具有不可估量的意义，完全可以搭建一个平台唱很多戏，针对多种疾病展开研究，特别是基因治疗领域前景无限，这种研发模式比较起一病一药的研发模式，无疑具有不可比拟的优势。
技术实现思路
[0005]为了解决传统CAR-T细胞扩增程序中，通过CD3/CD28单抗激活的单核细胞经白介素2进一步扩增后，大多数T细胞为高度分化的效应/记忆T细胞，自我更新能力较弱，移植后体内存活时间短，致使治疗效果较差的问题；本研究通过TSCM代替T细胞，扩增后TSCM比例高达44.41%，极大的改善移植后体内免疫细胞的存活时间，提高治疗效果。为了解决慢病毒载体的容量只能容纳CART的基本元件，对于更多的元件是无能为力的；同时也存在费用高、包装困难、免疫原性强、潜在致癌性强、CART疗效持续性不好等等显著缺陷，开发出一个崭新的CAR-TSCM载体平台，容纳下所有有助于治疗的新型元件，便于下一阶段的新产品开发。这个平台必须具有大容量、无序列特异性要求、弱免疫原性、高效而可控的外源基因表达能力、低成本、操作简便、持续发挥CAR-TSCM功效而避免其潜在致癌可能，以避免目前基于慢病毒的CAR-TSCM系统的显著缺点，极大的改进细胞治疗效果和扩大治疗范围。纵观现有的生物技术，只有转座子系统堪当此任，在国内第一次建立基于转座子原理的非病毒CAR-TSCM系统，并验证其功能，为日后下一代CAR-TSCM研发打下基础，同时其转基因平台也可以为其他疾病治疗提供公共平台。
[0006]本专利技术是通过以下步骤得到的：构建基于PiggyBac的CAR载体(PB-CAR-basic)，分别以CD19和Her2为靶标，测序验证序列正确。
[0007]探索PB-CAR-basic电转化TSCM细胞最佳条件，能达到最高转染效率、最佳成活率和最佳细胞毒性，用体外细胞杀伤实验初步证实其功能是正常的。
[0008]抽取成人血液或采集脐血，用淋巴分离液分离单个核细胞(PBMCs或UBMC)，CD4+T细胞或CD8+T细胞，用本人专利技术的TSCM诱导试剂盒诱导TSCM，直接用不同电转化仪和电转试剂盒，摸索电转化条件，以实现最佳的转化效率、生存率和TSCM细胞状态，并用适当浓度的puro进行筛选，经过扩增后，流式检测这些CAR-TSCM的状态。
[0009]用标准试剂盒和对应的目标癌细胞（例如CD19靶标的白血病细胞系Raji和HER2靶标的胃癌细胞系SGC-7901等）检测这些CAR-TSCM细胞的杀细胞毒性是否正常，并比较基于PiggyBac和慢病毒CAR-TSCM细胞之间活力的差别。
[0010]上述方法中，在获得本专利技术PB-CAR-TSCM之前，用生理盐水洗涤并重悬所述CAR-TSCM细胞3-4次，直至满足《中国药典》要求的无菌、内毒素的检测指标，保证本专利技术的PB-CAR-TSCM细胞在回输给患者时残留的本专利技术所述的培养基组分和诱导因子组合物不会引起患者不适反应。所述PB-CAR-TSCM细胞组合物包括1x10
5-3x107/ml本专利技术的PB-CAR-TSCM，优选为1x10
6-2x107/ml。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基础，所述人血白蛋白的质量体积含量为1-5%，优选为3%。
[0011]本专利技术还提供了一种本专利技术PB-CAR-TSCM细胞组合物的临床应用和疗效评估方
法。
[0012]本专利技术提供了一种PB-CAR-TSCM在临床肿瘤综合治疗中的应用方法，其中包括让患者知晓本专利技术PB本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种临床用PB-CAR-TSCM构建方法，其特征在于，包含从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞或脐血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞诱导扩增干细胞样记忆性T细胞（TSCM），通过转座子载体系统搭建这一新CAR-TSCM平台；（1）构建基于PiggyBac的CAR载体(PB-CAR-basic)，分别以CD19和Her2为靶标，测序验证序列正确；（2）探索PB-CAR-basic电转化TSCM细胞最佳条件，能达到最高转染效率、最佳成活率和最佳细胞毒性，用体外细胞杀伤实验初步证实其功能；优选步骤（2）中电压为200-250v，电转次数1-2次；（3）本发明包括抽取成人血液或采集脐血，用淋巴分离液分离单个核细胞(PBMCs或UBMC)，CD4+T细胞或CD8+T细胞或CD4-CD8-T细胞，用本人发明的TSCM诱导试剂盒诱导TSCM，直接用不同电转化仪和电转试剂盒，摸索电转化条件，以实现最佳的转化效率、生存率和TSCM细胞状态，并用适当浓度的puro进行筛选，经过扩增后，流式检测CAR-TSCM的状态；优选步骤（3）中，所述TSCM可用于制备CAR-TSCM细胞、UCAR-TSCM、TCR-TSCM或肿瘤浸润性淋巴细胞。2.权利要求1所述的制备PB-CAR-TSCM的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）外周血PBMC或脐血UBMC分离和T细胞纯化：（2）TSCM诱导试剂盒使用：1）D0天将TSCM-II 配成12.5-50ug/ml工作液，包被到培养瓶中，平放于37℃培养箱中大于2小时；2）T细胞按照细胞密度1
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106/mL用TSCM-III重悬，其中添加1-100ng/mL人白介素7、1-100ng /mL人白介素15和1-100ng/mL人白介素21、50-200ng/mL CD3单抗、50-200ng/mL CD28，第二天以后用 TSCM-I培养液对TSCM细胞进行扩增培养，第三天电转PB-CAR，经过12-15天的扩增培养，收获达到临床应用标准的PB-CAR-TSCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD3+-BV421/CD4+-APC-Cy/CD8+APC/CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE细胞；3）质量检测合格的PB-CAR-TSCM细胞装入50-1...
【专利技术属性】
技术研发人员：路春光，
申请(专利权)人：路春光，
类型：发明
国别省市：
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