临床用TSCM诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术涉及免疫细胞靶向治疗技术领域，特别涉及一种优化的从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞或脐血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞诱导扩增干细胞样记忆性T细胞（TSCM）的试剂盒及产品质量控制鉴定的试剂盒体系和应用，TSCM具有更强的增殖、自我更新和存活能力，能分化成中央记忆性T细胞（TCM），效应记忆性T细胞（TEM）和效应T细胞，小鼠动物实验表明，TSCM和其他分化的T细胞亚群相比，在体内有更强的抗肿瘤效应。在临床应用中，TSCM细胞培养过程中采用的试剂较多，细胞质量标准难以控制，很难在短时间内培养出质量均一的TSCM细胞，迫切需要开发简单、格式化的试剂盒，对临床应用具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
临床用TSCM诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用
本专利技术涉及免疫细胞靶向治疗
，特别涉及一种优化的从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞或脐血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞诱导扩增干细胞样记忆性T细胞（TSCM）的试剂盒及产品质量控制鉴定的试剂盒体系和应用。
技术介绍
过继性细胞治疗技术为打破肿瘤患者中枢和外周免疫耐受，恢复或增强其抗肿瘤免疫功能提供了一种有效的方法。然而目前回输的免疫细胞都是基于终末分化的效应性T细胞，在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。Gattinoni等在小鼠中发现一类具有自我更新能力的抗原特异性CD8+T细胞，这些称为TSCM(T-memorystemcells)的表面标志CD62L+CD45RA+CD95+CD45RO-，TSCM具有更强的增殖、自我更新和存活能力，能分化成中央记忆性T细胞（TCM），效应记忆性T细胞（TEM）和效应T细胞，小鼠动物实验表明，TSCM和其他分化的T细胞亚群相比，在体内有更强的抗肿瘤效应。本专利技术人2018年专利技术了《一种优化的临床用TCM分选、诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用》（专利号：201811194036.2），TSCM和TCM表型不同，基因表达谱和功能差异很小，二者属于同一个记忆性干细胞池，TCM在体外培养过程中容易分化成TEM，体外培养20天后，TCM大部分失去增值能力，变成分化状态，TSCM保持了较高比例的表型，CD4TSCM占比83%，CD8TSCM占比100%，具有分化状态的记忆性T细胞亚群的存在会扰乱长期免疫的建立，因此纯化T细胞亚群对于成功的过继性免疫细胞治疗具有重要的意义。在临床应用中，TSCM细胞培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中工作量大，培养时间长，工艺繁琐，不稳定，染菌风险大，细胞质量标准难以控制，许多技术人员很难在短时间内培养出质量均一的TSCM细胞，迫切需要开发简单、格式化的试剂盒，同时本专利技术通过进一步优化诱导因子组合物TSCM-III，节省了原材料，降低了生产成本；诱导培养前用TSCM-II包被培养板TSCM细胞增殖倍数提高了2-3倍，凋亡指数降低，活性提高了10%-20%，有效细胞的绝对数量提高了2-3倍；TCR基因转染前，用TSCM-II包被培养板可提高转染效率。本专利技术改进了工艺，这对临床上提高肿瘤治疗疗效，清除残留病灶，防止肿瘤的复发和转移具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决TCM在体外培养过程中容易分化成TEM的问题；本申请提供了一种从新鲜或低温冻存的人体外周血PBMC及脐血单个核细胞（UBMC）中分离纯化出T细胞，T细胞诱导TSCM，诱导活化率高的试剂盒及应用；纯化出T细胞相比PBMC直接诱导TSCM，纯化后诱导效率更高；然后将肿瘤特异或病毒特异性TCR基因转染自体TSCM，使免疫细胞治疗具有长效性和靶向性。本专利技术是通过以下步骤得到的：本专利技术提供一种TSCM诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用TSCM细胞无血清扩增完全培养液TSCM-I和TSCM细胞扩增包被液TSCM-II和诱导因子组合物TSCM-III：本专利技术提供一种临床用无血清TSCM细胞诱导扩增完全培养液TSCM-I，含有人体细胞生长必须的碳水化合物、促生长因子和激素、维生素、人血白蛋白、氨基酸、无机盐离子、微量元素、水、人白介素7、人白介素21和人白介素15。本专利技术不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养。本专利技术提供一种TSCM细胞扩增包被液TSCM-II，它含有重组人纤维蛋白片段和PBS，重组人纤维蛋白片段的工作浓度为12.5ug/ml-50ug/ml。本专利技术提供一种TSCM细胞诱导因子组合物TSCM-III，无血清TSCM细胞扩增完全培养液TSCM-I中添加50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、5-30ng/mL人白介素7、5-30ng/mL人白介素15和5-30ng/mL人白介素21。优选步骤（7）中T细胞按照细胞密度1×106/mL用TSCM-III重悬，其中添加8ng/mLIL-7、8ng/mL人白介素15、8ng/mLIL-7、80ng/mLCD3单抗、80ng/mLCD28。第二天以后用TSCM-I培养液对T细胞细胞进行诱导扩增培养，经过14-22天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TSCM细胞；对收获的TSCM细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PETSCM细胞；TSCM在体外活化过程中会获得CD45RO+的表达，同时保留CD45RA和CD62L的表达，这可能与CD3和CD28活化过程中下调CD45RA和CD62L的表达有关，这群细胞称为TSCM-like，二者抗肿瘤效率相同。质量检测合格的TSCM细胞装入50-100ml生理盐水中，制成免疫细胞制剂，配合肿瘤临床治疗需要静脉回输。本专利技术提及的无血清培养基和诱导因子或者TSCM细胞诱导液的原料可以从市场上购买，并且长期冷冻保存细胞和小分子蛋白的技术已经非常成熟，本领域技术人员完全可以利用上述技术保存组成本专利技术试剂盒的培养基和组合物。本专利技术还包括将上述TSCM细胞诱导试剂盒、无血清TSCM细胞扩增完全培养液TSCM-I和TSCM细胞扩增包被液体TSCM-II和TSCM-III装入专用洁净容器制备成试剂盒。本专利技术通过包被TSCM-II工作液，TSCM细胞增殖倍数提高了2-3倍，凋亡指数降低，活性提高了10%-20%，这对临床上提高肿瘤治疗疗效，清除残留病灶，防止肿瘤的复发和转移具有重要的意义。重组TCR逆转录病毒转染（培养后第3天）TSCM细胞。根据目的基因序列，设计引物，通过PCR技术克隆目的基因，构建重组人逆转录病毒PLXPXSN-TCRa12-2-IRES-Vβ7.1，用HEK293细胞包装完整病毒颗粒后以MOI=100的比例转染TSCM。转染前TSCM-II配成50ug/ml工作液，包被到六孔板中。培养后5天用DC负载肝癌肿瘤抗原AFP进行肿瘤抗原再刺激。台盼蓝染色法获取TSCM体外刺激活化后生长曲线（至体外培养至22天）。本专利技术另一方面还提供一种TSCM诱导后鉴定试剂盒，所述临床用TSCM细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双色抗体组合物，分别是CD3-BV421/CD4-APC-Cy/CD8APC/CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE和Annexin-FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；所述抗体按照体积1:1混合装于1支棕色EP管中，每20ul可检测一次，共计10-50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液；所述固定液是1%多聚甲醛。所述试剂盒制备中的质量控制鉴定方法，按照GMP要求，将相关物料密封装入试剂盒，按照《中国药本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种临床用TSCM诱导培养和质量控制鉴定的试剂盒体系，其特征在于，包含从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞或脐血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞诱导扩增干细胞样记忆性T细胞（TSCM）的试剂盒及产品质量控制鉴定的试剂盒体系和应用：/n（1）TSCM诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用TSCM细胞无血清扩增完全培养液TSCM-I和TSCM细胞扩增包被液TSCM-II和诱导因子组合物TSCM-III：/n本专利技术提供一种临床用无血清TSCM细胞诱导扩增完全培养液TSCM-I，含有人体细胞生长必须的碳水化合物、促生长因子和激素、维生素、人血白蛋白、氨基酸、无机盐离子、微量元素、水、人白介素7、人白介素21和人白介素15；本专利技术不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养；/n本专利技术提供一种TSCM细胞扩增包被液TSCM-II，它含有重组人纤维蛋白片段和PBS，重组人纤维蛋白片段的工作浓度为12.5ug/ml-50ug/ml；/n（2）本专利技术提供一种TSCM细胞诱导因子组合物TSCM-III，无血清TSCM细胞扩增完全培养液TSCM-I中添加50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、5-30ng/mL人白介素7、5-30ng /mL人白介素15和5-30ng /mL人白介素21；/n优选步骤（2）中T细胞按照细胞密度1×10...

【技术特征摘要】
1.一种临床用TSCM诱导培养和质量控制鉴定的试剂盒体系，其特征在于，包含从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞或脐血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞诱导扩增干细胞样记忆性T细胞（TSCM）的试剂盒及产品质量控制鉴定的试剂盒体系和应用：
（1）TSCM诱导培养试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用TSCM细胞无血清扩增完全培养液TSCM-I和TSCM细胞扩增包被液TSCM-II和诱导因子组合物TSCM-III：
本发明提供一种临床用无血清TSCM细胞诱导扩增完全培养液TSCM-I，含有人体细胞生长必须的碳水化合物、促生长因子和激素、维生素、人血白蛋白、氨基酸、无机盐离子、微量元素、水、人白介素7、人白介素21和人白介素15；本发明不排除可以采用上述无血清完全培养基之外的培养基实施培养；
本发明提供一种TSCM细胞扩增包被液TSCM-II，它含有重组人纤维蛋白片段和PBS，重组人纤维蛋白片段的工作浓度为12.5ug/ml-50ug/ml；
（2）本发明提供一种TSCM细胞诱导因子组合物TSCM-III，无血清TSCM细胞扩增完全培养液TSCM-I中添加50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、5-30ng/mL人白介素7、5-30ng/mL人白介素15和5-30ng/mL人白介素21；
优选步骤（2）中T细胞按照细胞密度1×106/mL用TSCM-III重悬，其中添加8ng/mLIL-7、8ng/mL人白介素15、8ng/mLIL-7、80ng/mLCD3单抗、80ng/mLCD28，第二天以后用TSCM-I培养液对T细胞细胞进行诱导扩增培养，经过14-22天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TSCM细胞；对收获的TSCM细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PETSCM细胞；TSCM在体外活化过程中会获得CD45RO+的表达，同时保留CD45RA和CD62L的表达，这可能与CD3和CD28活化过程中下调CD45RA和CD62L的表达有关，这群细胞称为TSCM-like，二者抗肿瘤效率相同；
（3）本发明另一方面还提供一种TSCM诱导后鉴定试剂盒，所述临床用TSCM细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双色抗体组合物，分别是CD3-BV421/CD4-APC-Cy/CD8APC/CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE和Annexin-FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；所述抗体按照体积1:1混合装于1支棕色EP管中，每20ul可检测一次，共计10-50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液，所述固定液是1%多聚甲醛；
（4）本发明还包括将上述TSCM细胞诱导试剂盒、无血清TSCM细胞扩增完全培养液TSCM-I和TSCM细胞扩增包被液体TSCM-II和TSCM-III装入专用洁净容器制备成试剂盒。


2.应用权利要求1所述的试剂盒体系制备TSCM的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外周血PBMC或脐血UBMC分离和T细胞纯化：
（2）TSCM诱导试剂盒使用：
1）D0天将TSCM-II配成12.5ug/ml工作液，包被到培养瓶中，平放于37℃培养箱中大于2小时；
2）T细胞按照细胞密度1×106/mL用TSCM-III重悬，其中添加8ng/mL人白...

【专利技术属性】
技术研发人员：路春光，
申请(专利权)人：路春光，
类型：发明
国别省市：吉林;22