一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种简便的制备通用型免疫细胞的方法及其应用，该方法将同种异体的免疫细胞与特定的细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得具有高度免疫活性的通用型免疫细胞培养物。该方法简便，易于操作，采用同种异体免疫细胞，可以提高免疫细胞制剂的质量、降低细胞疗法的成本和改善其安全性。此外，临床长期大量实际应用证明了该通用型免疫细胞安全可靠、持久有效、没有排异反应。因此，可作为其他类型通用型免疫细胞制剂的母体细胞，例如CAR‑T、TCR‑T，用于过继性细胞免疫治疗等领域。本发明专利技术解决了目前细胞免疫治疗成本高、安全性差、效率低等问题，为细胞免疫疗法的应用和推广提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用。
技术介绍
近几十年来，肿瘤治疗领域取得了很大进展。特别是针对肿瘤相关抗原(TAA)的基于细胞的疗法已经发展迅速。通过产生由编码scFv，共刺激结构域(CD28或TNFRSF9)的基因和用于T细胞增殖和活化的CD247信号传导结构域组成的CAR构建体，将T细胞工程化以具有攻击肿瘤细胞的能力。原则上，通过T细胞表面上的scFv识别TAA来激活CAR-T细胞，然后通过scFv连接的细胞内的信号传导结构域随后被激活以诱导涉及T细胞增殖，活化和细胞因子产生的下游信号传导途径。目前，CAR-T细胞疗法的有效功能已经在包括血液恶性肿瘤、实体瘤、自身免疫疾病和哮喘等过敏性疾病的各种疾病中得到证实。此外，抗原特异性T调节细胞(Tregs)和基因编辑的T细胞似乎有利于控制过敏性哮喘的炎症。CART疗法不同于传统药物，而主要是一种整合了CAR基因的自体T细胞疗法。这一疗法须快速完成抽血、分离、激活、转染、扩增、制剂、放行、冻存、运输和给药。因此CART细胞疗法是一个相当昂贵和个性化的过程，需要昂贵的措施来收集患者的细胞，设计这些细胞，并在每个阶段将细胞重新注入患者体内，并进行适当的质量控制。另外，传统的嵌合抗原受体(CAR)具有固定的设计，并且一种类型的CART细胞只能靶向一种抗原表位。这种刚性的设计限制了临床应用，并导致极高的制造成本。2017年FDA批准了两种CAR-T细胞疗法(Yescarta和Kymriah)，CART细胞疗法已成为治疗某些类型癌症的最有希望的疗法之一。这一成功为优化CART细胞的生产提供了机会，使患者更容易得到治疗。但是，目前两种批准的具有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞产物来自自体T细胞。这些批准用于临床的CART细胞必须在定制的基础上生成。由于昂贵且漫长的生产过程，这种自体T细胞生产平台仍然是大规模临床应用的重要限制因素。生产失败也存在固有风险。个性化，定制的自体CART细胞生产过程也对各种肿瘤类型的广泛应用产生了影响。为了更广泛地实施先进细胞疗法并降低成本，使用同种异体“通用”细胞疗法产品将是有利的，所述同种异体“通用”细胞疗法产品可以以类似于生物制药药物产品的方式存储在细胞库中并应要求提供。因此，通用同种异体T细胞可以用于制备通用CART细胞，其可以用作大规模临床应用的“现成”即用型生物治疗制剂。这将大大减少传统CART细胞治疗所需的费用和时间。目前，通用型CAR-T的研发主要包括免疫细胞的类型及其制备，以及CAR-T的载体和结构。主要的技术路线为：消除内源性αβT细胞受体(TCR)的表达以防止移植物抗宿主反应；基因编辑技术；其他类型的免疫细胞；iPSC技术。当考虑同种异体CART细胞输注时，必须避免宿主与移植物和移植物抗宿主排异反应，以防止过继转移细胞的排斥，宿主组织损伤并引起显著的抗肿瘤结果。目前采用的一种修饰方法是在引入CAR的同时敲除阻止同种异体治疗的基因，例如内源性T细胞受体。使其在其细胞表面不存在TCRαβ受体以防止它们的同种异体反应性。这一技术显然进一步增加了制备操作的复杂性，而且还有敲除TCRαβ受体不完全的隐患。由于可以同时编辑多个基因靶标，一些临床试验采用CRISPR/Cas9系统用于CAR-T细胞改善。这些强大技术的结合有望为临床应用提供新一代基于CAR-T细胞的免疫疗法，即通过基因编辑技术敲除内源性TCR，并改善T细胞的抗肿瘤活性和安全性。但是，这一方法也会进一步增加制备操作的复杂性，同时也会增加生产成本。自然杀伤(NK)细胞可以异种移植，并有可能成为现成的产品，使CAR-NK细胞疗法成为通用产品。这些产品可能比CAR-T细胞疗法更安全。科学家报告了一种基于NK-92细胞工程的新型PCa治疗方法，CAR识别人前列腺特异性膜抗原(PSMA)，其在前列腺肿瘤细胞中过表达。在CAR转导后，NK-92/CAR细胞在体外获得针对表达PSMA的前列腺癌细胞的高和特异性裂解活性，并且还进行脱颗粒并响应抗原识别产生高水平的IFN-γ。但是这一技术需要对效应物进行致死照射，这是靶向NK-92细胞临床应用所要求的安全措施，可以完全消除复制，但不影响表型和短期功能。另有研究者探索了基于诱导多能干细胞(iPSC)衍生的自然杀伤(NK)细胞开发现成细胞疗法的技术路线。提出了设计iPSC衍生的NK(iPSC-NK)细胞以增强免疫细胞的功能，延长持久性和促进细胞归巢的策略。但迄今为止，还没有看到iPSC衍生的CTL(iPSC-CTL)的报道。本专利技术在先申请的制备抗原特异性的免疫细胞类药物(CN101626781B、CN102847143B、CN102847144B)在近10年临床应用中，治疗了大约近800例肿瘤病人，年龄范围为18个月-93岁，最多使用500多次，历时最长为十年。外周血白细胞总数的范围为0.9-30.0×109/L。经过临床多中心应用证明：安全性好、无移植物抗宿主排异反应(GVHD)和自体免疫性疾病，而传统的使用DLI治疗的病人大约有50～60％发生GVHD。因此，本申请人拟基于在先专利的基础设计一种制备通用同种异体T细胞的方法，并且为其他类型通用型免疫细胞制剂提供母体细胞，例如CAR-T、TCR-T或其他免疫细胞类型，用于过继性免疫细胞疗法等领域，以期提高免疫细胞的质量、降低细胞疗法的成本和改善其安全性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种简便的制备通用型免疫细胞的方法及其应用。所制备的通用型免疫细胞安全可靠、持久有效、没有移植物抗宿主排异反应。本专利技术为解决上述技术问题，采用以下技术方案：本专利技术的第一方面是提供一种制备通用型免疫细胞的方法，包括如下步骤：步骤1，将同种异体的免疫细胞(例如单个核细胞)与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得通用型免疫细胞培养物；步骤2，从步骤1中获得的培养物中分离出细胞群；其中，细胞因子来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。进一步地，上述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化性细胞因子和转化生长因子中的任意一种或几种。进一步地，上述细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-15、干扰素中的一种或几种。进一步地，上述细胞因子的浓度为20万-500万单位/L。进一步地，上述细胞因子的浓度为50万-200万单位/L。进一步地，上述有丝分裂原选自刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖中的任意一种或几种。进一步地，上述有丝分裂原的浓度为10万-1000万单位/L。进一步地，上述有丝分裂原的浓度为0.1mg-10mg/L。进一步地，上述免疫佐剂选自生物性佐剂、无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂和弗氏佐剂中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备通用型免疫细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1，将同种异体的免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得通用型免疫细胞培养物；/n步骤2，从步骤1中获得的所述培养物中分离中出细胞群；/n其中，所述细胞因子来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备通用型免疫细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将同种异体的免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得通用型免疫细胞培养物；
步骤2，从步骤1中获得的所述培养物中分离中出细胞群；
其中，所述细胞因子来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子来源于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化性细胞因子和转化生长因子中的任意一种或几种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-15、干扰素中的一种或几种。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子的浓度为20万-500万单位/L。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子的浓度为50万-200万单位/L。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有丝分裂原选自刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖中的任意一种或几种。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有丝分裂原的浓度为10万-1000万单位/L。


8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有丝分裂原的浓度为0.1mg-10mg/L。


9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫佐剂选自生物性佐剂、无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂和弗氏佐剂中的任意一种或几种，浓度为0.01ml-1ml/L。


10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞为异体细胞或自体细胞，来源于外周血或脐带血。


11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞的浓度为1×103-1×1011个/ml。


12.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华，
申请(专利权)人：上海星华生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31