一种CAR-NK细胞培养基及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种CAR‑NK细胞培养基及其应用，所述培养基为含有MICA和IL‑12的基础培养基。本发明专利技术采用含有MICA和IL‑12的基础培养基培养CAR‑NK细胞，不仅提高了CAR‑NK细胞的扩增数量，而且使CAR‑NK细胞保持良好的肿瘤细胞杀伤毒性，应用于肿瘤生物治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种CAR-NK细胞培养基及其应用
本专利技术属于细胞培养
，涉及一种CAR-NK细胞培养基及其应用。
技术介绍
NK细胞(自然杀伤细胞，naturalkillercell)又称大颗粒性淋巴细胞，与γδT细胞和NKT细胞共同发挥固有免疫和获得性免疫功能。一方面，当机体发生感染或创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的方式快速、广泛、特异识别抗原，及时清除病原微生物和变异细胞，发挥固有免疫作用；另一方面，NK细胞参与适应性免疫应答，影响αβT细胞和B细胞的效应功能。在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体识别肿瘤细胞被活化，又可以被单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等辅助细胞活化，上述辅助细胞通过模式识别受体应答内外环境的变化，再通过分泌可溶性因子或直接接触的方式将信号传递给NK细胞。目前，制约NK细胞临床应用的主要障碍在于难以获得数量充足的NK细胞，在体外实现NK细胞的大规模扩增是NK细胞治疗要解决的关键问题。外周血中NK细胞数量少，而肿瘤病人的外周血中NK细胞的数量和活性明显下降，不同人的NK细胞的性质有很大差别。应用嵌合抗原受体(CAR)修饰NK细胞进行治疗肿瘤，对NK细胞的数量要求高。现有技术存在着扩增后的NK细胞寿命短、活性不足等问题。因此，寻找更高效的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了CAR-NK细胞培养基及其应用，所述培养基具有多种活化NK细胞的配体，可以显著提高NK细胞的数量，延长NK细胞的寿命，提高NK细胞的活性。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种CAR-NK细胞培养基，所述培养基为含有MICA和IL-12的基础培养基。本专利技术中，MICA是NK细胞表面最主要的活化性受体NKG2D的配体，对NK细胞具有显著的活化作用，IL-12主要由巨噬细胞和树状细胞产生，可以与NK细胞表面的IL-12受体结合，活化NK细胞；本专利技术采用含有MICA和IL-12的基础培养基培养CAR-NK细胞，不仅提高了CAR-NK细胞的扩增数量，而且使CAR-NK细胞保持良好的肿瘤细胞杀伤毒性，应用于肿瘤生物治疗。优选地，所述IL-12包括IL-12A和IL-12B。优选地，所述MICA包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA。优选地，所述IL-12A包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:2：MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS。优选地，所述IL-12B包括如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；SEQIDNO:3：MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS。优选地，所述MICA的浓度为1～100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。优选地，所述IL-12A的浓度为1～100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。优选地，所述IL-12B的浓度为1～100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。优选地，所述培养基还包括IL-2。优选地，所述IL-2的浓度为20～40U/mL，例如可以是20U/mL、21U/mL、22U/mL、23U/mL、24U/mL、25U/mL、26U/mL、27U/mL、28U/mL、29U/mL、30U/mL、31U/mL、32U/mL、33U/mL、34U/mL、35U/mL、36U/mL、37U/mL、38U/mL、39U/mL或40U/mL。优选地，所述培养基还包括血清。优选地，所述血清的体积百分比为1％～5％，例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。优选地，所述基础培养基包括Eagle培养液、RPMI-1640培养基或Ham’sF-10中的任意一种或至少两种的组合。第二方面，本专利技术提供了一种CAR-NK细胞培养方法，所述方法包括采用第一方面所述的培养基培养CAR-NK细胞的步骤。优选地，所述CAR-NK细胞的接种密度为(1-5)×104/mL，例如可以是1×104/mL、2×104/mL、3×104/mL、4×104/mL或5×104/mL，优选为(1-3)×本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CAR-NK细胞培养基，其特征在于，所述培养基为含有MICA和IL-12的基础培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种CAR-NK细胞培养基，其特征在于，所述培养基为含有MICA和IL-12的基础培养基。


2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述IL-12包括IL-12A和IL-12B；
优选地，所述MICA包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述IL-12A包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述IL-12B包括如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述MICA的浓度为1～100ng/mL；
优选地，所述IL-12A的浓度为1～100ng/mL；
优选地，所述IL-12B的浓度为1～100ng/mL。


4.根据权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括IL-2；
优选地，所述IL-2的浓度为20～40U/mL。


5.根据权利要求1-4任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括血清；
优选地，所述血清的体积百分比为1％～5％。


6.根据权利要求1-5任一项所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括Eagle培养液...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤朝阳，秦乐，吴迪，邓殷健，吴海鹏，王翠花，冯世忠，冯嘉昆，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广东昭泰体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44