一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用，所述分离方法包括如下步骤：(1)将分离洗净的肿瘤组织剪碎，稀释；(2)将稀释液与透明质酸酶、DNA酶和Ⅱ型胶原酶混合，消化，过滤，离心收集细胞沉淀；(3)去除细胞沉淀中的红细胞、成纤维细胞和纤维细胞；(4)最后用淋巴细胞分离液去除肿瘤细胞，得到肿瘤浸润淋巴细胞。本发明专利技术所涉及的分离方法简单易操作，分离得到的肿瘤浸润淋巴细胞活性高、纯度高，且显示出良好的抗瘤活性。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用
本专利技术属于细胞分离与培养
，具体涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用，尤其涉及一种细胞活性好、纯度高的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法及其应用。
技术介绍
TILs(肿瘤浸润淋巴细胞)是存在于肿瘤间质内的具有抗原特异性的以淋巴细胞为主的致敏淋巴细胞群体。TILs经体外生物制剂如重组人白介素-2(rIL-2)刺激活化后，其生长扩增能力和杀瘤活性均明显增强。一般来说，新鲜制备的原位TIL中绝大多数为T细胞。不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例有显著差异。除黑色素瘤、头颈部肿瘤外，其他肿瘤中以CD8+T细胞为主。新鲜分离的TIL中CD25+细胞百分率较低，随着体外加IL-2培养时间的延长，CD25+细胞百分率逐渐升高。NK细胞的标记(CD16、CD56)在TIL体外加IL-2培养过程中有先增高后降低的趋势。因此，TIL在多种肿瘤中具有抗自身肿瘤的特异性，可望为今后更有效地进行肿瘤的生物治疗甚至预防提供强有力的依据和新的途径。目前针对肿瘤浸润淋巴细胞的常规分离，主要有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括如下步骤：/n(1)将分离洗净的肿瘤组织剪碎，稀释；/n(2)将稀释液与透明质酸酶、DNA酶和Ⅱ型胶原酶混合，消化，过滤，离心收集细胞沉淀；/n(3)去除细胞沉淀中的红细胞、成纤维细胞和纤维细胞；/n(4)最后用淋巴细胞分离液去除肿瘤细胞，得到肿瘤浸润淋巴细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括如下步骤：
(1)将分离洗净的肿瘤组织剪碎，稀释；
(2)将稀释液与透明质酸酶、DNA酶和Ⅱ型胶原酶混合，消化，过滤，离心收集细胞沉淀；
(3)去除细胞沉淀中的红细胞、成纤维细胞和纤维细胞；
(4)最后用淋巴细胞分离液去除肿瘤细胞，得到肿瘤浸润淋巴细胞。


2.如权利要求1所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(1)所述将分离洗净的肿瘤组织剪碎是指剪碎至尺寸小于1mm×1mm×1mm的颗粒；
优选地，步骤(1)所述稀释使用的试剂包括含青霉素和链霉素的RPMI1640培养基。


3.如权利要求1或2所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(2)所述透明质酸酶为质量浓度为0.6-0.8％的透明质酸液；
优选地，步骤(2)所述DNA酶为质量浓度为0.15-0.25％的DNA酶液；
优选地，步骤(2)所述Ⅱ型胶原酶为质量浓度为1.1-1.3％的Ⅱ型胶原酶液；
优选地，步骤(2)所述稀释液、透明质酸液、DNA酶液和Ⅱ型胶原酶液的体积比为(40-50):(2-3):(2-3):(5-6)。


4.如权利要求1-3中任一项所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(2)所述消化的温度为35-40℃，时间为4-6h；
优选地，步骤(2)所述过滤使用80-120目钢筛；
优选地，步骤(2)所述离心的速度为1500-2000rpm，时间为3-6min。


5.如权利要求1-4中任一项所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(3)所述去除红细胞的方法为：将细胞沉淀与红细胞裂解液混合，离心收集细胞沉淀；
优选地，所述离心的速度为700-900rpm，时间为3-8min。


6.如权利要求1-5中任一项所述的肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，步骤(3)所述去除成纤维细胞和纤维细胞的方法为：将细胞沉淀用含10％的FBS完全培养基重悬后置于培养皿，培养40-45...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢俊锋，游同钊，
申请(专利权)人：南京元荟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32