一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，涉及生物医药领域。具体而言，该方法在细胞培养前，使用浓度为0.1‑2％的明胶溶液包被培养瓶，之后吸除明胶溶液，接种细胞。相较于已有的专利方法，在培养CIK细胞前进行明胶包被，可显著增加目标细胞和自然杀伤细胞比例，增强细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。该方法不仅适用于CIK细胞培养，也可适用于自然杀伤细胞培养，具有极大的市场前景及经济价值。

In vitro activation of cytokine induced killer cells

【技术实现步骤摘要】
一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法。
技术介绍
癌症是严重威胁人类健康的疾病，随着人们寿命的延长，癌症已经是一种常见多发病，也是临床工作者经常面对的难题。癌症的治疗手段包括手术治疗、化学治疗、放射治疗及生物治疗。作为癌症治疗的较新颖的手段，生物治疗正逐渐从临床试验阶段进入临床应用，成为癌症治疗不可或缺的方式。细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-inducedkillercells，CIK细胞)，也是应用于临床新方法。在西欧，CIK细胞治疗已经获得政府批准，用于急性白血病及骨髓增生异常综合征的治疗。我国也已经开展了多项临床试验，用于治疗肝癌、肺癌、肾癌等实体瘤。CIK细胞也用于预防造血干细胞移植后复发[1]。此外，在CIK细胞群中，细胞毒作用的主要效应细胞是CD3+/CD56+的细胞，亦即是表达CD56的T淋巴细胞，因此具有MHC非限制性及限制性杀伤能力，因此，异体CIK细胞也适用于严重巨细胞病毒及EB病毒感染的控制[2,3]。总体上讲，CIK细胞治疗对于预防手术后癌症复发，以及某些类型白血病及骨髓增生异常综合征，都可能获得令人满意的效果。在CIK细胞培养最终产品中有多种免疫细胞，包括自然杀伤细胞(NK细胞)，表达CD56分子而不表达CD3分子，称为CD3-/CD56+，T淋巴细胞(CD3+/CD56-)以及CD3+/CD56+细胞。常规CIK细胞培养中，培养的目的在于获得高比例的CD3+/CD56+细胞，这群细胞是CIK培养的目标细胞。在组成CIK细胞的群体中，具有较强肿瘤细胞杀伤能力的是CD3+/CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞，即目标细胞和NK细胞。但是，在常规CIK细胞培养体系中，NK细胞比例较低，发挥细胞毒作用的主要细胞为CD3+/CD56+细胞。然而，由于血液样品供者个体差异，以及常规体系中抗CD3单克隆抗体对T淋巴细胞刺激的非特异性，CD3+/CD56+细胞比例常较低，尤其是2周培养方案更是如此[4-6]。因此，有人通过抗人胸腺细胞球蛋白替代抗CD3抗体[4,5]，或使用重组人IL-15替代重组人IL-2[6]，以期获得更好的培养效果。然而，这些改变并没有提高NK细胞比例，培养体系中缺少了一种功能细胞。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是CIK细胞培养后，目标细胞比例偏低，杀伤功能不足。本专利技术的一个目的是提供一种简易的刺激CIK细胞活化的方法，使获得的CIK细胞群中含有较多的CD3-/CD56+细胞(NK细胞)和CD3+/CD56+细胞(CIK目标细胞)，细胞群体的杀伤能力更高，可能具有更好的临床应用前景。本专利技术经过多次实验，找到了一种可以同时促使CD3+/CD56+细胞(CIK目标细胞)和CD3-/CD56+细胞(NK细胞)增殖的活化剂。利用这种活化剂处理后的培养器皿，使用常规CIK培养方法培养细胞，即可获得含较高比例目标细胞的细胞群。该方法操作简单，并可同时获得较高比例的NK细胞，从而具有更强的细胞毒效力。本专利技术提供的一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，包括以下步骤：1)活化剂包被：在培养瓶中加入含有0.1-2％(g/100ml)明胶的明胶溶液；明胶溶液的溶剂为0.85％(g/100ml)的NaCL，或含生理盐水的磷酸盐缓冲液(PBS)；将明胶溶液的液体平铺于培养瓶底部，置于4℃过夜，或2周内使用，或置于37℃至少2小时。包被温度为不导致溶液凝固或结冰的温度，优选4℃、室温或37℃。2)活化剂处理：取出培养瓶，吸除活化剂，加入生理盐水，轻轻晃动使盐水平铺于培养瓶底部，吸除生理盐水，即可使用该培养瓶接种细胞。3)单个核细胞的分离、血浆处理：用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获取抗凝外周血或脐带血中的单个核细胞，计细胞数；同时收集血浆，在56℃30分钟灭活后，离心去除血小板；处理后的血浆用于以下细胞培养。4)细胞培养：将单个核细胞悬浮于培养基中，加入血浆2-10％，γ干扰素1000-2000U/ml，在37℃、5％CO2、95％湿度的环境下培养24小时。之后，加入IL-2和IL-15，二者终浓度分别为200-2000U/ml和10-100ng/ml。加入抗人CD3单克隆抗体，200-1000ng/ml，继续培养48小时。5)补液及转瓶培养：补充新鲜培养基，体系含血浆2-10％，IL-2和IL-15，后者终浓度分别为200-2000U/ml和10-100ng/ml。当培养基总体积达到培养瓶最大量时，将细胞悬液转移至底面积为225cm2的培养瓶中。同时，收集原培养瓶中的残留细胞，转入新培养瓶中。向原培养瓶中加入冷的生理盐水(4℃)，使之平铺于培养瓶底部，静置5分钟后，吹打并将细胞转移至离心管中。500g离心8分钟，将细胞悬浮加入底面积为225cm2的培养瓶中。6)培养及细胞收集：继续培养至总时间2-3周，离心收集细胞。计细胞数。步骤1)中，优选的：(1)明胶的浓度为1％(g/100ml)；(2)使用PBS作为溶解明胶的溶剂；(3)将培养瓶置于4℃过夜，或者，置于4℃，2周内使用。步骤3)中，优选的，将收集的血浆灭活后，立即置于-20℃，5分钟后取出离心。优选的，离心去除血浆中血小板时，离心力达到3000g，离心时间15分钟。去除血浆中的血小板，有利于后续的细胞培养扩增。步骤4)中，优选的，单个核细胞的浓度为3×106个/ml；重组人γ干扰素浓度为2000U/ml；37℃培养24小时后，加入IL-2的浓度为500U/ml，IL-15浓度为50ng/ml。步骤5)中，优选的，补充的新鲜培养基体积与补液前培养基体积相同，亦即，等量补液。优选的，新鲜培养基中不含IL-2。优选的，新鲜培养基中含IL-15浓度为50ng/ml。为转移原培养瓶中的残留细胞，向原培养瓶中加入冷的生理盐水(4℃)，使之平铺于培养瓶底部，静置5分钟后，吹打并将细胞转移至离心管中。500g离心8分钟，将细胞悬浮加入底面积为225cm2的培养瓶中。步骤6)中，优选的，培养总时间为2周，离心收集细胞时，离心力为500g，8分钟。本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：本专利技术相比于已有的专利方法，是一种更为简单有效的杀伤细胞(CIK细胞、NK细胞)的体外扩增培养技术，有效地降低了杀伤细胞的体外扩增培养成本。在包被步骤中，加入明胶，显著地增加NK细胞的比例；具有极大的市场前景和经济价值。附图说明为使本专利技术更好地被理解，以传统方法为对照，对本专利技术具体实施如下例。附图为主要结果显示，其中：图1.实施例1的传统方法培养外周血CIK细胞，48h时在显微镜下观察的细胞形态；图2.实施例1的本专利技术方法培养外周血CIK细胞，48h时在显微镜下观察的细胞形态；图3.实施例1的传统方法培养外周血CIK细胞，1周时在显微镜下观察的细胞形态；图4.实施例1的本专利技术方法培养外周血CIK细胞，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，在细胞培养前，使用明胶溶液包被培养器皿。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，在细胞培养前，使用明胶溶液包被培养器皿。


2.如权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述明胶溶液为，含明胶的盐溶液，或，含明胶的水溶液。


3.如权利要求2所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述明胶溶液中，明胶的浓度为0.1％(克/100ml)以上。


4.如权利要求3所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述明胶溶液中，明胶的浓度为0.1-2％(克/100ml)。


5.如权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述包被的作用温度为4℃、室温或37℃。


6.如权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭子宽，潘慧欣，王恒湘，哈小琴，
申请(专利权)人：北京科霖恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11