改良TIL细胞诱导的TCM/TSCM细胞及应用制造技术

本发明专利技术涉及免疫细胞靶向治疗实体瘤技术领域，特别涉及一种改良肿瘤浸润T淋巴细胞（TIL）诱导分化为TCM和TSCM细胞及应用。TIL为聚集在肿瘤病灶区域内的CD8+T淋巴细胞，在肿瘤免疫机制中处于免疫应答和调控作用的前沿，为攻克实体瘤带来一线曙光，但从肿瘤组织分离培养肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞很困难，而且TIL大多处于耗竭状态，很难扩增。为了解决从肿瘤组织分离制备TIL得率低，增殖活性低的问题，本人通过将肿瘤组织块和低温冻存的PBMC或新鲜分离的PBMC共培养的方法，获得改良TIL细胞，将其诱导成TIL‑TCM或TIL‑TSCM细胞，有望提供具有更强生存能力和效应功能的肿瘤反应性T细胞。

【技术实现步骤摘要】
改良TIL细胞诱导的TCM/TSCM细胞及应用
本专利技术涉及免疫细胞靶向治疗实体瘤
，特别涉及一种改良肿瘤浸润T淋巴细胞（TIL）诱导分化为记忆性免疫细胞（TCM）和干细胞样记忆性T细胞（TSCM），还涉及TIL-TCM和TIL-TSCM细胞的应用。
技术介绍
过继性细胞治疗技术为打破肿瘤患者中枢和外周免疫耐受，恢复或增强其抗肿瘤免疫功能提供了一种有效的方法，但实体瘤治疗效果较差。肿瘤浸润T淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes，TIL)，其主要为聚集在肿瘤病灶区域内的CD8+T淋巴细胞，在肿瘤免疫机制中处于免疫应答和调控作用的前沿，TIL细胞为攻克实体瘤带来一线曙光，但从肿瘤组织分离培养原代肿瘤细胞以及肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞很困难，而且TIL大多是处于耗竭状态的T细胞，很难扩增。TCM和TSCM细胞在体内再次遭遇相同抗原时可迅速活化发挥免疫效应，同时具有自我更新能力，能够提供更为长期的免疫保护，可能为过继性细胞治疗提供更为合适的免疫效应细胞，有望在回输体内后建立更长期的抗肿瘤免疫。分离制备改良TIL细胞并诱导成TIL-TCM和TIL-TSCM有望提供具有更强生存能力和效应功能的实体肿瘤反应性T细胞。
技术实现思路
为了解决从肿瘤组织分离制备TIL得率低，增殖活性低的问题，本人通过将肿瘤组织块和低温冻存的PBMC或新鲜分离的PBMC共培养的方法，获得改良TIL细胞，并将其诱导成TIL-TCM或TIL-TSCM细胞，TIL-TCM或TIL-TSCM诱导活化率高的诱导方法。从外周血中分离PBMC或复苏低温冻存的PBMC细胞，并用CD3磁珠分选纯化出CD3阳性的T细胞，将大小1-5mm3的肿瘤组织块和T细胞共培养，用本人专利技术的TCM诱导培养试剂盒（申请号2018111113228）和TSCM诱导培养试剂盒（申请号2019103666958），诱导为TIL-TCM细胞或TIL-TSCM细胞。解决肿瘤患者TIL细胞增殖能力差和免疫无能的问题。一种改良TIL细胞制备，诱导活化为TIL-TCM或TIL-TSCM的方法，包括以下步骤：健康人PBMC冻存复苏，或抽取患者外周血并分离PBMC，并用CD3磁珠分选纯化出CD3阳性的T细胞，取患者肿瘤组织，手术剪剪成1-5mm3的组织块，和T细胞共培养。TIL-TCM诱导：D0天用TCM-II，包被六孔板或培养瓶，平放于37℃培养箱中大于2小时。上述T细胞按照密度1×106/mL用TCM-III重悬，其中添加300-2000u/mL人干扰素γ、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL人白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mLIL-2。第二天以后用TCM-I培养液对TIL-TCM细胞进行扩增培养，经过8-10天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TIL-TCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD8+CD62L+CD45RO+和CD4+CD62L+CD45RO+细胞。TIL-TSCM诱导：D0天用TSCM-II包被六孔板或培养瓶，平放于37℃培养箱中大于2小时。上述T按照细胞密度1×106/mL用TSCM-III重悬，其中添加50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、5-30ng/mL人白介素7、5-30ng/mL人白介素21，5-30ng/mL人白介素15。第二天以后用TSCM-I培养液对TIL-TSCM细胞进行扩增培养，经过15-30天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TIL-TSCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD3+-BV421/CD4+-APC-Cy/CD8+APC/CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE细胞。台盼蓝染色法获取TIL-TCM细胞及TIL-TSCM细胞体外刺激活化后生长曲线。本实验结果为改良的TIL细胞诱导的TCM或TSCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础，解决了肿瘤患者T细胞增殖能力差和免疫无能问题。本专利技术所述肿瘤组织为人体实体恶性肿瘤组织，包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等。本专利技术所述疾病包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等。本专利技术的有益效果：1）本专利技术为改良的TIL细胞诱导的TCM或TSCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础，解决了肿瘤患者TIL细胞增殖能力差和免疫无能问题；2)目前制备的TIL免疫细胞在体内难以长期存活，极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞具有长效记忆性，提高了过继性细胞治疗的临床疗效；3）本专利技术获得的TIL-TCM诱导效率达到行业内领先水平，CD8+TIL-TCM比例高达95.95%，CD4+TIL-TCM细胞比例高达94.15%；4）本专利技术获得的TIL-TSCM诱导效率达到行业内领先水平，CD8+TIL-TSCM比例高达100%，CD4+TIL-TSCM细胞比例高达99.56%。附图说明：图1体外诱导培养8天后CD8+TIL-TCM和CD4+TIL-TCM比例；图2TIL-TCM体外刺激活化后生长曲线；图3体外诱导培养15天时CD8+TIL-TSCM和CD4+TIL-TSCM比例；图4TIL-TSCM体外刺激活化后生长曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明：一、PBMC细胞的分离与冻存：a.PBMC细胞的分离：外周血用电动助吸器按照每管不多于35mL，平均分至50mL离心管中，931g，离心8min，吸取上层血浆至50mL离心管中，取1.5mL于EP管中，标记，-80℃保存。用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层，形成完整的界面。596g，离心20min。可见明显分层。吸弃第一层上清，小心轻柔地将第二层的白色细胞层分别吸至不同的洁净50mL离心管中。分别向各管中加NA，稀释混匀，定容至40mL/管。931g，离心8min。吸弃上清，加NA重悬细胞。冻存处理前留取细胞悬液计数和活力测定。b.PBMC细胞冷冻保存：纯化后细胞重悬于自配冷冻保存液中，轻轻混匀后置-20℃冰箱冷却平衡5-15min到4℃以下，同时把冻存管放4℃冰箱平衡15min。分装入2-10mL冻存管内，管壁做好标识。放在样本冻存盒，转移至程序降温盒仪器，最终将细胞保存于-196℃液氮内，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种临床用改良TIL-TCM和TIL-TSCM诱导培养和质量控制鉴定的方法，其特征在于，包含从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞和肿瘤组织块共培养，获得改良TIL，用本人专利技术的TCM诱导试剂盒和TSCM诱导试剂盒将TIL诱导扩增为TIL-TCM和TIL-TSCM的方法及应用：/n（1）从外周血中分离PBMC或复苏低温冻存的PBMC细胞，并用CD3磁珠分选纯化出CD3阳性的T细胞，将大小1-5mm

【技术特征摘要】
1.一种临床用改良TIL-TCM和TIL-TSCM诱导培养和质量控制鉴定的方法，其特征在于，包含从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞中分离纯化T细胞，T细胞和肿瘤组织块共培养，获得改良TIL，用本人发明的TCM诱导试剂盒和TSCM诱导试剂盒将TIL诱导扩增为TIL-TCM和TIL-TSCM的方法及应用：
（1）从外周血中分离PBMC或复苏低温冻存的PBMC细胞，并用CD3磁珠分选纯化出CD3阳性的T细胞，将大小1-5mm3的肿瘤组织块和T细胞共培养；
（2）TIL-TCM诱导：D0天用TCM-II，包被六孔板或培养瓶，平放于37℃培养箱中大于2小时，上述（1）中T细胞按照密度1×106/mL用TCM-III重悬，其中添加300-2000u/mL人干扰素γ、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL人白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mLIL-2，第二天以后用TCM-I培养液对TIL-TCM细胞进行扩增培养，经过8-10天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TIL-TCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD8+CD62L+CD45RO+和CD4+CD62L+CD45RO+细胞；
（3）TIL-TSCM诱导：
D0天用TSCM-II包被六孔板或培养瓶，平放于37℃培养箱中大于2小时，上述（1）中T按照细胞密度1×106/mL用TSCM-III重悬，其中添加50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、5-30ng/mL人白介素7、5-30ng/mL人白介素21，5-30ng/mL人白介素15，第二天以后用TSCM-I培养液对TIL-TSCM细胞进行扩增培养，经过15-30天的扩增培养，收获达到临床应用标准的TIL-TSCM细胞，并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测，细胞鉴定结果表明，细胞活性达到95%以上，同时含有较高比例的CD3+-BV421/CD4+-APC-Cy/CD8+APC/CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE细胞；
（4）TIL-TCM和TIL-TSCM诱导培养后鉴定：用本人发明的TCM和TSCM鉴定试剂盒进行鉴定。


2.应用权利要求1所述的方法制备TIL-TCM和TIL-TSCM的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外周血PBMC分离或冻存PBMC复苏和T细胞纯化：
（2）实体瘤组织块获取：将肿瘤组织加工成体积为1-5mm3的组织块；
所述肿瘤组织为人体实体恶性肿瘤组织，包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等；
（3）质量检测合格的TIL-TCM或TIL-TSCM细胞装入50-100ml生理盐水中，制成免疫细胞制剂，配合肿瘤临床治疗需要静脉回输。

【专利技术属性】
技术研发人员：路春光，
申请(专利权)人：路春光，
类型：发明
国别省市：吉林;22